腹腔注射右美托咪定后小鼠大腦響應區域初探

李 昊，許德嬌，岑華蕊，程 娟，王烈成

右美托咪定(dexmedetomidine，Dex)作為一種高選擇性的α2腎上腺素受體激動劑，它可產生與正常睡眠相似、可喚醒的效果，具有鎮靜、鎮痛、抗焦慮和應激保護作用[1]。Dex可使機體體溫和血壓在安全范圍內有一定的下降；Dex通過激活藍斑(locus coeruleus，LC)的下行抑制系統發揮鎮痛作用，由脊髓α2受體介導[2]；具有神經保護作用[3]，在抵抗應激、炎癥和腦損傷中具有器官保護作用[4]。目前該藥物已經被廣泛應用于臨床。催產素(oxytocin，OXT)是一種神經肽，具有多種功能，包括收縮子宮，尤其以妊娠子宮更加敏感；在哺乳期可以促進分泌乳汁；具有神經保護作用，在抗焦慮、降低炎癥反應、學習和記憶中發揮作用[5]。Dex是否可以作用在OXT神經元，尚未見報道。該實驗研究Dex對丘腦室旁核(paraventricular nucleus of hypothalamus，PVN)、丘腦室上核(supraoptic nucleus，SON)腦區的c-Fos陽性神經元細胞和OXT神經元共標記情況，進一步探究Dex是否會增強OXT釋放進而增強神經保護和抗炎作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗動物 成年SPF小鼠(C57BL/6J)，年齡8～10周(體質量21～26 g)，采購于浙江維通利華實驗動物技術有限公司。小鼠可自由獲得標準飼料和無菌水，在室溫(26±1) ℃，濕度40%～70%，光/暗循環12 h/12 h(從08：00—20：00開燈)。符合安徽醫科大學動物倫理委員會要求(倫理號：20190235)，并在實驗中努力減少小鼠的數量及減輕它們所經歷的任何疼痛或者不適。

1.1.2藥品與試劑 右旋美托咪定注射液購自江蘇恒瑞醫藥股份有限公司；兔源一抗c-Fos抗體、鼠源一抗c-Fos抗體購自美國Abcam公司；兔源一抗AVP抗體、兔源一抗OXT抗體購自美國ImmunoSta公司；羊抗兔和羊抗鼠二抗均購自美國Alexa Fluor分子探針公司；山羊血清封閉液、Fluoromount水性封片劑購自德國Sigma-aldrich公司。曲拉通X-100 購自上海昂一生物公司。

1.1.3實驗儀器 灌流蠕動泵(河北齊力恒流泵有限公司)；冷凍切片機(德國徠卡公司)；小鼠腦槽儀(深圳瑞沃德公司)；熒光倒置顯微鏡、玻片掃描儀(日本奧林巴斯公司)；共聚焦顯微鏡(德國蔡司公司)。

1.2 方法

1.2.1實驗動物分組及給藥方式 取8～10周C57小鼠18只，隨機分為Saline組和Dex組，給藥方式為腹腔注射(ip)，每只小鼠注射劑量為：0.1 ml/10 g。其中，Saline組給予生理鹽水，Dex組給予Dex(100 μg/kg)。

1.2.2小鼠完整大腦取材 小鼠在下午15：00給藥前使用0.04 %異氟烷吸入麻醉后，迅速進行腹腔注射。然后將小鼠在籠中放置120 min后，使用戊巴比妥鈉(80 mg/kg)將小鼠麻醉，再依次用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)、4%多聚甲醛(PFA)通過心臟灌流對大腦固定，剝離顱骨取腦后放入蔗糖溶液脫水3 d。

1.2.3小鼠大腦全腦冰凍切片 首先將脫水完整的大腦放在腦槽儀下沿冠狀面均切成兩部分，切后光滑面作為底座，使用OCT包埋劑包埋后放在冰凍切片機的冰座臺上。冷凍完成后進行全腦厚度40 μm一層的切片，按順序放入含有0.01 mol/L PBS溶液的24孔板中。

1.2.4免疫熒光

1.2.4.1c-Fos免疫熒光染色 取出腦片放入孔板中，用PBS漂洗腦片3次(每次10 min)，5%山羊血清在PBST(0.05% Triton X-100)放入37 ℃水浴鍋封閉1 h，加入相應兔來源的c-Fos單一抗體(1 ∶4 000)于4 ℃孵育過夜。PBS漂洗3次，加入相應兔源綠色熒光二抗室溫避光孵育2 h。PBS漂洗3次，細胞核用DAPI(1 ∶2 000)孵育20 min。PBS漂洗1次。

1.2.4.2c-Fos和OXT神經元免疫熒光共染色 挑選、漂洗、封閉腦片同1.2.4.1加入鼠來源的c-Fos單一抗體(1 ∶1 000)和兔來源的OXT神經元抗體(1 ∶2 000),于4 ℃孵育過夜。PBS漂洗3次，加入相應兔源紅色熒光和鼠源綠色熒光二抗室溫避光孵育2 h。PBS漂洗3次。

1.2.5免疫熒光成像后陽性細胞計數方法 本課題中免疫熒光分為兩部分。第一部分大腦腦區的c-Fos細胞表達是利用奧林巴斯玻片掃描儀顯微成像。第二部分特定腦區的c-Fos細胞和OXT神經元共標記是利用蔡司共聚焦顯微成像。對于玻片掃描儀顯微成像后的腦片利用Image J軟件通道拆分和劃定的腦區自動計數，為保證計數精確，再人工對每個自動計數的陽性細胞數進行校準。對于蔡司共聚焦顯微成像的腦片，使用蔡司成像軟件來觀測各層細胞數量。切片厚度40 μm，采用10 μm一層進行層掃，每張腦片成像約有4～6幅。根據細胞前后成像的變化，判斷c-Fos細胞和OXT神經元是否在同一層，若是，則可判斷為共標記細胞。

2 結果

2.1 Dex對睡眠腦區腹外側視前區(ventrolateral preoptic nucleus， VLPO)和運動皮質的c-Fos細胞影響免疫熒光實驗結果顯示：與Saline組相比，Dex組M1/M2區域的c-Fos細胞表達降低，差異有統計學意義(t=9.64，P<0.001)(圖1 A、B、E)；與Saline組相比，Dex組促睡眠腦區VLPO中c-Fos細胞表達升高，差異有統計學意義(t=-5.15，P<0.05)(圖1 C、D、F)。

圖1 運動皮質M1/M2和促睡眠腦區VLPO的免疫熒光代表圖(n=5)A：Saline組M1/M2腦區免疫熒光代表圖；B：Dex組M1/M2腦區免疫熒光代表圖；C：Saline組VLPO腦區免疫熒光代表圖；D：Dex組VLPO腦區免疫熒光代表圖；E：M1/M2腦區c-Fos陽性細胞數量統計圖；F：VLPO腦區c-Fos陽性細胞數量統計圖；1：×10；2：×20；3：×5；與Saline組比較：*P<0.05，***P<0.001

2.2 Dex對促覺醒相關腦區的c-Fos細胞表達的影響免疫熒光實驗結果顯示：與Saline組相比，Dex組LC腦區中c-Fos的表達降低，差異有統計學意義(t=4.45，P<0.01)(圖2 A、B、K)；與Saline組相比，Dex組外側下丘腦(lateral hypothalamic area， LH)中c-Fos細胞表達降低，差異有統計學意義(t=7.40，P<0.001)(圖2 C、D、L)；與Saline組相比，Dex組腹側結節乳頭體核(ventral tuberomammillary nucleus, TMN)腦區c-Fos細胞表達降低，差異有統計學意義(t=5.00，P<0.01)(圖2 E、F、M)；與Saline組相比，Dex組背外側背蓋核(laterodorsal tegmental nucleus， LDT)，臂旁核(parabigeminal nucleus， PB)兩個腦區c-Fos細胞表達降低，差異有統計學意義(tPB=9.17，tLDT=6.44，P<0.01)(圖2 G～J、N、O)。

圖2 促覺醒相關腦區的免疫熒光c-Fos代表圖(n=5)A：Saline組LC腦區免疫熒光代表圖；B：Dex組LC腦區免疫熒光代表圖；1：×10；2：×20；C：Saline組LH腦區免疫熒光代表圖；D：Dex組LH腦區免疫熒光代表圖；1：×5；2：×10；E：Saline組TMN腦區免疫熒光代表圖；F：Dex組TMN腦區免疫熒光代表圖；1：×5；2：×10；G：Saline組LDT腦區免疫熒光代表圖；H：Dex組LDT腦區免疫熒光代表圖；1：×5；2：×20；I：Saline組PB腦區免疫熒光代表圖；J：Dex組PB腦區免疫熒光代表圖；1：×5；2：×10；K～O：LC、LH、TMN、LDT、PB腦區c-Fos細胞數量統計圖；與Saline組比較：**P<0.01，***P<0.001

2.3 Dex對大腦感覺神經核SFO、AP、SOL的c-Fos細胞表達影響免疫熒光實驗結果顯示：與Saline組相比，Dex組的小鼠穹窿下器(subfornical organ， SFO)腦區c-Fos細胞表達增高，差異有統計學意義(t=-5.22，P<0.01)(圖3 A、B、E)；與Saline組相比，Dex組延髓最后區(area postrema， AP)和孤束核(solitary tract， SOL)腦區的c-Fos細胞表達增高，差異有統計學意義(tAP=-12.15，tSOL=-7.05，P<0.001)(圖3 C、D、F、G)。

圖3 Dex對機體感覺神經核SFO、AP、SOL的影響(n=5)A：Saline組SFO腦區免疫熒光代表圖；B：Dex組SFO腦區免疫熒光代表圖；1：×5；2：×10；C：Saline組AP、SOL腦區免疫熒光代表圖；D：Dex組AP、SOL腦區免疫熒光代表圖；0：AP、SOL腦區 ×5；1：AP腦區 ×20；2：SOL腦區 ×10；E～G：SFO、AP、SOL腦區c-Fos細胞數量統計圖；與Saline組比較：**P<0.01，***P<0.001

2.4 Dex對PVN、SON、SCN腦區的c-Fos細胞表達的影響免疫熒光實驗結果顯示：與Saline組相比，Dex組SON腦區c-Fos細胞表達增高，差異有統計學意義(t=-3.73，P<0.05)(圖4 A、B、G)；Dex組PVN和視交叉上核(suprachiasmatic nucleus， SCN)腦區c-Fos細胞表達差異無統計學意義(圖4 C～F、H、I)。

圖4 SON、PVN、SCN腦區免疫熒光c-Fos表達代表圖(n=5)A：Saline組SON腦區免疫熒光代表圖；B：Dex組SON腦區免疫熒光代表圖；1：×10；2：×20；C：Saline組PVN腦區免疫熒光代表圖 ×10；D：Dex組PVN腦區免疫熒光代表圖 ×10；E：Saline組SCN腦區免疫熒光代表圖 ×10；F：Dex組SCN腦區免疫熒光代表圖 ×10；G～I：SON、PVN、SCN腦區c-Fos細胞數量統計圖；與Saline組比較：*P<0.05

2.5 Dex對PVN、SON中OXT神經元和c-Fos細胞共標記的影響本實驗中，小鼠腹腔注射給藥后進行免疫熒光c-Fos細胞和OXT神經元共成像。顯微成像后，統計了共標記神經元數量占總的OXT神經元和總的c-Fos細胞的比例。本研究選擇年齡相仿的小鼠，OXT神經元在個體間差別不大，圖5 F餅圖顯示的是Dex組和Saline組對應的腦區總OXT神經元數量是基本一致。染色和統計質量無誤后，進行共標記統計，結果顯示，與Saline組相比，Dex組PVN、SON腦區共標記神經元細胞數占總OXT神經元數量差異無統計學意義(圖5A～E)。

統計共標神經元細胞數占該腦區總的c-Fos細胞的比例，結果顯示：與Saline組相比，Dex組在PVN腦區差異無統計學意義；Dex組在SON腦區比例下降，差異有統計學意義(t=-3.73，P<0.05)(圖5 G)。

圖5 Saline組及Dex組PVN、SON腦區免疫熒光共標記代表圖(n=4) ×20A：Saline組PVN腦區免疫熒光共標記代表圖；B：Dex組PVN腦區免疫熒光共標記代表圖；C：Saline組SON腦區免疫熒光共標記代表圖；D：Dex組SON腦區免疫熒光共標記代表圖；E：c-Fos細胞和OXT神經元共標記數與OXT神經元的比例；F：PVN、SON腦區總OXT神經元數量及共標記神經元數占總OXT神經元比例；G：c-Fos細胞和OXT神經元共標數與c-Fos細胞數量的比例；1：紅色熒光標記的OXT神經元；2：綠色熒光標記的c-FOS細胞；3：共標記圖；箭頭：指示共標記的細胞的位置；與Saline組比較：*P<0.05

3 討論

結果顯示：Dex對促睡眠相關腦區細胞表達顯著激活，如VLPO腦區；而對促覺醒與運動等相關腦區細胞表達顯著抑制，如LC、LH、TMN、LDT、PB、M1/M2等腦區。

作為一種麻醉劑，Dex不可避免地會導致運動功能下降，本課題中，運動皮質M1/M2的c-Fos細胞表達顯著降低。VLPO是位于下丘腦外側與睡眠密切相關的促睡眠腦區，在整個睡眠過程中，VLPO表現非常活躍，c-Fos細胞表達顯著增高[6]。LC是經典的促覺醒的核團，其內含有豐富的去甲腎上腺素合成神經元，這些神經元在整個中樞神經系統中發出彌散投射，LC-去甲腎上腺素系統在喚醒、應激反應中起主要作用[7]。LH是前腦的重要組成部分，是覺醒、防御和新陳代謝的重要控制器，包括食欲素神經元、黑色素濃縮激素神經元、γ-氨基丁酸能神經元，食欲素神經元被鑒定為促覺醒神經元[8]，免疫熒光顯示Dex可以顯著抑制其活性。LDT在引發和維持REM睡眠中起重要作用[9]，其主要含有膽堿能和非膽堿能神經元。免疫組化實驗證實，LDT在快速眼動睡眠剝奪后的反彈期間膽堿能和非膽堿能神經元與Fos細胞共標記數量顯著增多[9]。本課題免疫熒光實驗顯示，Dex降低LDT區域c-Fos細胞的數量，這與Dex減少REM睡眠的結果相一致。有文獻表明，Dex可以在整個睡眠周期中會提高非快速眼動睡眠的比例[10]。此外，LDT中一半以上的膽堿能神經元表達有α2受體，提示Dex可能通過LDT的α2受體抑制神經元活性，從而減少REM睡眠。然而，Dex是否直接抑制LDT神經元，需要電生理膜片鉗技術進一步驗證。PB位于腦橋灰質的重要促覺醒核團之一，免疫熒光結果顯示，Dex可減少PB的c-Fos細胞表達，提示Dex誘導的鎮靜催眠作用可通過抑制PB神經元興奮來介導。SOL是延髓背側的一個主要感覺核，接收心血管、內臟、呼吸、味覺和觸覺的信息[11]。SFO位于第三腦室，在心血管調節，能量平衡，免疫反應和水礦物質平衡方面發揮作用。SFO缺乏血腦屏障，可以直接感受腦脊液中水礦物質的變化，尤其對Na+水平更加敏感，控制水和鹽的攝入[12]。如果被激活可能代表機體水鹽失衡，會主動尋求飲水。Dex的使用可以降低血壓，當機體血壓下降時，血管緊張素Ⅱ發揮升壓作用，其中已被證實SFO與AngⅡ作用致升壓效應有關系[13]。

PVN和SON腦區存在大量AVP、OXT神經元，負責產生和調控此類激素的釋放。本研究結果顯示Dex組PVN、SON腦區c-Fos細胞和OXT神經元共標記數與OXT神經元比例無差異性，但共標記數與c-Fos細胞數量比例降低。結果分析是Dex組SON腦區的c-Fos細胞表達數量較Saline組增高，Saline組激活的多數c-Fos細胞和OXT神經元進行共標記，但Dex組增加的c-Fos細胞并未和OXT神經元更多地進行共標記，這一結果表明，Dex可能并不會對小鼠機體的OXT神經元產生影響，但增加的c-Fos細胞和哪類神經元進行共標記，還需進一步研究。