芪玉三龍湯通過PD-1信號通路增強Th1免疫反應抑制肺癌轉移

焦安男，吳 歡，朱 潔，張 梅，李 平，李澤庚，陳 楊

在全球惡性腫瘤發(fā)病率和病死率的排名中，肺癌均居于首位[1]，其中約85%是非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)[2]，它的產生變化與腫瘤微環(huán)境改變及機體免疫系統失去平衡有緊密聯系。近幾年，免疫疾病的醫(yī)治與調節(jié)發(fā)展迅速，在NSCLC的治療中，程序性死亡蛋白-1(programmed death protein-1, PD-1)及其配體PD-L1抑制劑等的應用取得了良好的效果。中醫(yī)藥輔助治療肺癌的效果已在多項研究中得到驗證[3]，芪玉三龍湯(Qiyu Sanlong Decoction,QYSLD)處方來源基于長期臨床實踐，前期研究[4-5]結果顯示QYSLD可以抑制肺癌增殖。為進一步明確QYSLD抑制肺癌轉移的作用，該研究構建了Lewis肺癌細胞株(lewis lung cancer cell line,LLC)細胞皮下移植瘤小鼠模型，從QYSLD通過介導PD-1信號通路，增強Th1免疫反應，調節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境的角度探討其對肺癌轉移影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗癌株 LLC購自南京科白生物，用改良的RPMI-1640的培養(yǎng)基，其中包含10%胎牛血清、100 U青霉素、100 μg鏈霉素，在37 ℃含5% CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。傳代一次的時間為2～3 d，開始用于實驗的細胞狀態(tài)為對數生長期。

1.1.2實驗動物 體質量(20±2)g的無菌級雄性C57BL/6小鼠(批準號：AHUCM-mouse-2019013)72只，鼠齡8周，購自常州卡文斯實驗動物有限公司，合格證號：SCXK(蘇)2011-0003，飼養(yǎng)于安徽醫(yī)科大學動物中心動物房。

1.1.3實驗藥物 QYSLD草藥(30 g黃芪、10 g玉竹、6 g壁虎、6 g地龍、20 g龍葵、20 g白花蛇舌草、20 g薏苡仁、6 g澤漆、10 g莪術及10 g貝母)購自安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院中藥房，將其放1.34 L蒸餾水(1/10，W/V)中進行1 h的浸泡處理，武火煮沸30 min，文火60 min。用兩個70 μm白色細胞濾網上下疊加將提取液過濾，殘渣浸泡于1.07 L蒸餾水中，煮沸40 min。再通過兩個70 μm白色細胞濾網上下疊加再次過濾。在50 ℃真空中將兩種提取液混合濃縮至濃度為4.0 g/ml，制得QYSLD懸浮液。放置于4 ℃冰箱儲存，一周內使用。用0.9%氯化鈉溶液將注射用順鉑(Cisplatin，DDP)稀釋至0.367 mg/ml。

1.1.4實驗試劑 DMEM高糖細菌液、標準胎牛血清FBS、磷酸鹽緩沖液PBS(美國HyClone公司)；RPMI-1640培養(yǎng)基(美國Invitrogen公司)；NH4Cl/Tris紅細胞裂解液(上海哈靈生物有限公司)；胰酶細胞消化液、青鏈霉素溶液(上海Beyotime公司)；CCK-8試劑盒、BD CBA小鼠炎癥試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)；皮爾斯低密度脂蛋白細胞毒性檢測試劑盒(美國Pierce Biotechnology公司)；CD3、CD4、CD8、CD44抗體、PD1抗體(德國Merck公司)；Annexin V-PE試劑(德國Calbiochem公司)；熒光素FITC、熒光素PE-Cy5(美國Pierce公司)；絲裂霉素C(瑞士Roche公司)。

1.1.5實驗儀器 培養(yǎng)瓶、6孔板、96孔培養(yǎng)板(美國Corning公司)；CKX41型倒置顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；MCO-175型CO2細胞培養(yǎng)箱(日本Sanyo公司)；LD4-8型臺式低速離心機(北京醫(yī)用離心機廠)；70 μm尼龍細胞過濾器(上海碧云天生物技術有限公司)；FACSCalibur 流式細胞儀(美國BD公司)；小鼠CD4+、CD8+T淋巴細胞濃縮裝置(美國bd-bioscience公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1構建小鼠皮下移植瘤模型 將LLC細胞(對數生長期)用胰酶消化液消化離心(1 800 r/min×5 min)收集，再用無血清DMEM培養(yǎng)基重懸使其濃度為1×107個/ml，吸取0.2 ml細胞懸液，皮下注射入小鼠右前肢，構建小鼠皮下移植瘤模型[6]，觀察30 min，小鼠與之前比較無異常，說明接種成功。

1.2.2分組及給藥 模型建立10 d 后，皮下肉眼看到及摸到3～5 mm3的小圓狀硬物，待觸及的硬物長到1 cm3左右以后，將每組中隨機一只小鼠的移植瘤取出進行病理檢測是否均為癌細胞，以此來判斷建模是否成功。設置對照(Control)組、順鉑(DDP)組、芪玉三龍湯(QYSLD)組和聯合(DDP+QYSLD)組，18只/組。

小鼠的順鉑給藥劑量=7.34 mg/[kg·(0.2 ml/10 g)]=0.367 mg/ml[5]，小鼠的腹腔注射體積為0.2 ml/10 g，但反復注射順鉑會造成小鼠腎功能不全，所以注射藥量減半，即小鼠的腹腔注射體積為0.2 ml/20 g。臨床上，成人的QYSLD給藥量為134 g/60 kg=A。QYSLD小鼠給藥劑量設為B=9.01(小鼠和人的等效劑量折算系數)×A=20.12 g/kg(與1倍的成人臨床用藥相當)，小鼠給藥體積為0.2 ml/10 g。所以，QYSLD小鼠給藥劑量為1.006 g/ml(與1倍的成人臨床用藥相當)，其4倍即4.024 g/ml。預實驗結果為高劑量與中劑量效果相當，即與2倍的成人臨床用藥相當，因此正式實驗采用2倍給藥，即40.24 g/kg，為方便給藥計算，采用40 g/kg。

實驗分組給藥如下：① 對照組：每日按照0.1 ml/10 g 0.9%氯化鈉溶液灌胃，每日1次；② 順鉑組：第1、3、5日腹腔注射0.2 ml DDP溶液；③ QYSLD組：40 g/(kg·d)中藥藥液灌胃，每日1次；④ 聯合(DDP+QYSLD)組：40 g/(kg·d)中藥藥液灌胃，每日1次，同時0.2 ml DDP溶液每2 d注射1次。

1.2.3觀察記錄小鼠一般狀態(tài) 每天觀察記錄各組小鼠的精神活力、進食、體質量、毛發(fā)變化、大小便等各項生長情況。

1.2.4繪制腫瘤生長曲線 第1天開始每隔3 d測量1次其皮下腫瘤的長徑(a)和短徑(b)測量小鼠皮下腫瘤的長徑(a)和短徑(b)，計算腫瘤體積(V)，公式為:V(cm3) = ab2/2。

1.2.5標本收集與準備 21 d連續(xù)給藥，在給藥的第7、14和21天每組隨機選取6只小鼠處死，解剖小鼠，取出脾臟，分離脾淋巴細胞，檢測并分析腫瘤抗原特異性T細胞表面PD-1表達水平及腫瘤特異性Th1細胞反應。給藥21 d后，將兩側肺臟從處死的小鼠胸腔中完整取出，利用解剖顯微鏡觀察統計肺表面轉移瘤結節(jié)數量。

1.2.6制備小鼠脾臟CD4+和CD8+T細胞 在給藥的第7、14和21天處死小鼠，分離脾臟，使用2.5 ml注射器柱塞通過70 μm尼龍細胞過濾器制備脾臟單細胞懸浮液，用NH4Cl/Tris溶液溶解紅細胞后，分別用小鼠CD4+T、CD8+T淋巴細胞濃縮裝置分離CD4+和CD8+T細胞，純度大于95%。

1.2.7ELISA法檢測小鼠腫瘤抗原特異性Th1細胞反應 將骨髓細胞(bone marrow-derived dendritic cell，BMDC)從C57BL/6小鼠股骨和脛骨取出，用含2 mmol的谷氨酰胺、100 U/ml青霉素、10%胎牛血清、100 μg/ml鏈霉素和20 ng/ml GM-SF的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)基每隔3 d更換1次。培養(yǎng)8 d后，將BMDC與LLC細胞裂解物(10 mg/ml)共培養(yǎng)16 h，加入50 μg/ml絲裂霉素C作用30 min。將接種LLC細胞21 d小鼠的脾臟淋巴細胞(1×106個/ml)與BMDC(5×105個/ml)共培養(yǎng)60 h，細胞增殖情況通過CCK-8試劑盒進行檢測。收集上述共培養(yǎng)后的細胞上清液，采用BD CBA小鼠炎癥試劑盒應用ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清液中IFN-γ和TNF-α水平。按照50 ∶1的比例將上述與BMDC共培養(yǎng)后的小鼠脾臟淋巴細胞與LLC細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，所處的培養(yǎng)環(huán)境設置為37 ℃、5% CO2，進行24 h的細胞培養(yǎng)。為了檢測對LLC細胞的殺傷效應，應用ELISA法通過皮爾斯低密度脂蛋白細胞毒性檢測試劑盒檢測細胞培養(yǎng)上清液中乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase，LDH)水平。

1.2.8流式細胞術檢測小鼠PD-1細胞及記憶性CD4+T細胞凋亡情況 按照上述時間和方法處死小鼠獲得單個脾細胞，用CD16/CD32將脾細胞放在冰上孵育10 min封閉Fc非特異結合位點。將處理后的脾細胞分別與熒光素PE標記的PD-1抗體及FITC標記的CD3、CD4、CD8抗體在冰上孵育20 min后檢測確定記憶T細胞中PD-1的陽性比例；將脾細胞與熒光素FITC標記的抗CD44抗體和熒光素PE-Cy5標記的抗CD4抗體，再進行Annexin V-PE凋亡染色試劑盒進行染色來檢測記憶性CD4+T細胞的凋亡情況。將CD4+T細胞內的Foxp3用熒光素FITC染色，通過BD FACS Calibur流氏細胞儀將所有染色后的細胞上機檢測，使用CELLQuest軟件進行分析。

1.3 統計學處理采用SPSS 19.0統計軟件進行分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 QYSLD對小鼠一般情況的影響小鼠給藥第5天開始，DDP組小鼠精神活力最差，進食減少，毛發(fā)枯燥，動作遲緩，反應力降低，聚集性強，體質量降低量大，大小便量減少；Control組小鼠第7天開始精神活力一般，毛發(fā)略枯，飲食和大小便均良好；QYSLD組及聯合組小鼠精神活力尚可，狀態(tài)相較DDP組優(yōu)，飲食良好，體質量降低不明顯，毛發(fā)狀態(tài)尚好。其中，小鼠的生長情況，QYSLD組最好，聯合組次之，均明顯優(yōu)于DDP組。

2.2 QYSLD對小鼠腫瘤生長的抑制作用觀察腫瘤生長曲線可知，Control組與QYSLD組曲線變化相近，DDP組與聯合組曲線變化幾乎一致(圖1)。從腫瘤生長曲線可知，Control組與QYSLD組曲線變化相近，DDP組與聯合組曲線變化幾乎一致(圖1)。將四個組別進行兩因素析因設計的方差分析，得出QYSLD抑制腫瘤體積與質量效果不明顯，差異無統計學意義，而DDP可以抑制腫瘤體積與質量，差異有統計學意義(P<0.01)，聯合組差異無統計學意義。結果顯示，QYSLD可以平和地抑制肺癌移植瘤，尚且不能得出其與DDP聯合使用有顯著提高療效的作用。

圖1 腫瘤生長曲線

2.3 QYSLD對小鼠CD4+T細胞免疫反應上調作用將BMDC用特異性LCC抗原刺激，與小鼠脾淋巴細胞共培養(yǎng)，為評價CD4+T細胞的功能，觀察細胞培養(yǎng)上清液中IFN-γ和TNF-α的水平及細胞增殖情況，結果顯示，聯合組小鼠T細胞增殖能力最強，IFN-γ和TNF-α的分泌水平最高，QYSLD組次之，對照組和順鉑組較低，差異有統計學意義(P<0.01)。CD4+調節(jié)性T細胞的功能通過流式細胞術分析CD4+CD25+Foxp3+調節(jié)性T細胞(Treg)數目來觀察，結果顯示，Control組小鼠中CD4+CD25+Foxp3+調節(jié)性T細胞數目顯著增加，QYSLD組CD4+CD25+Foxp3+調節(jié)性T細胞數目略增加，DDP組增加幅度比QYSLD組大，聯合組略減少，上述結果表明QYSLD和DDP聯合使用能夠上調肺癌荷瘤小鼠CD4+T細胞免疫反應。見圖2。

圖2 QYSLD對肺癌荷瘤小鼠CD4+T細胞免疫反應的影響A：細胞培養(yǎng)上清液中TNF-α的分泌水平；B：細胞培養(yǎng)上清液中IFN-γ的分泌水平；C：T淋巴細胞自身增殖能力變化程度；D：隨著治療時間的增加CD4+CD25+Foxp3+調節(jié)性T細胞數目的變化情況；E：不同組CD4+CD25+Foxp3+調節(jié)性T細胞數目在不同時間點的變化情況；與Control組比較：**P<0.01；與QYSLD組比較：##P<0.01

2.4 QYSLD對小鼠CD8+T細胞特異性殺腫瘤細胞效應的影響小鼠脾淋巴細胞用抗原遞呈激活后，將其與LLC細胞共培養(yǎng)24 h后，隨著接種LLC細胞時間的延長，細胞培養(yǎng)上清液中LDH的含量逐漸增多，殺細胞效應逐漸增強。CD8+T細胞特異性殺腫瘤細胞效應在同一時間點QYSLD組和聯合治療組兩組小鼠均高于Control組(P<0.001)。結果表明QYSLD能夠上調肺癌荷瘤小鼠CD8+T細胞特異性殺腫瘤細胞效應。見圖3。

圖3 QYSLD對肺癌轉移小鼠CD8+T細胞特異性殺腫瘤細胞效應上調作用與Control組比較：*P<0.05，***P<0.001

2.5 QYSLD對小鼠T細胞中PD-1陽性細胞的比例的影響21 d給藥后，流式細胞術檢測小鼠脾臟T細胞中PD-1陽性細胞的比例顯示，在對照組和順鉑組小鼠中PD-1陽性細胞的比例高于其他組(P<0.001)。結果表明QYSLD可能通過下調PD-1信號途徑抑制肺癌的增殖。見圖4。

圖4 QYSLD對肺癌荷瘤小鼠T細胞中PD-1陽性細胞的比例的下調作用A：CD3+ T細胞中PD-1陽性細胞的比例；B：CD3+ CD4+T細胞中PD-1陽性細胞的比例；C：CD3+ CD8+T細胞中PD-1陽性細胞的比例；D：流式細胞術檢測試驗21 d之后各個組小鼠T細胞中PD-1陽性細胞的百分比；與Control組比較：***P<0.001

2.6 QYSLD對小鼠CD4+記憶性T細胞中凋亡細胞比例的下調作用連續(xù)21 d給藥后，用流式細胞術檢測肺癌荷瘤小鼠脾細胞中CD4+細胞凋亡狀況，得出DDP組和Control組小鼠的CD4+細胞的凋亡比例顯著高于QYSLD組和聯合組(P<0.001)。以上表明QYSLD可能通過減少PD-1信號途徑降低記憶性T細胞凋亡比例，增強機體免疫功能，阻止肺癌的轉移。見圖5。

圖5 QYSLD抑制肺癌荷瘤小鼠CD4+記憶性T細胞凋亡A：不同治療組小鼠CD44high CD4+T細胞的凋亡水平；B：不同治療組小鼠CD44high CD4+T細胞的凋亡情況；與Control組比較：***P<0.001

2.7 QYSLD對小鼠腫瘤細胞肺轉移的抑制作用連續(xù)21 d給藥后處死小鼠，打開胸腔完整取出肺臟，利用解剖顯微鏡觀察統計肺表面轉移瘤結節(jié)數量，結果顯示，與Control組相比，聯合組小鼠肺轉移瘤結節(jié)最少，DDP組次之(P< 0.001)，QYSLD組也明顯減少(P<0.001)。這表明QYSLD能夠抑制小鼠腫瘤細胞肺轉移。見圖6。

圖6 QYSLD能夠抑制肺癌荷瘤小鼠腫瘤細胞肺轉移A：不同組治療后小鼠肺表面轉移結節(jié)圖片；B：各組小鼠肺表面轉移結節(jié)數目比較；C：各組小鼠肺表面轉移結節(jié)體積比較；與Control組比較：***P<0.001

3 討論

近年來，在癌癥治療的各種措施中，其中免疫治療備受關注,尤其是免疫檢查點分子PD-1及其配體PD-L1的發(fā)現已成為腫瘤免疫治療中里程碑式的標志。多項研究[7]揭示PD-1/PD-L1信號通路與肺癌相關，臨床應用PD-1/PD-L1抑制劑治療肺癌，取得了持久有效的藥物反應和令人滿意的治療效果。

機體免疫功能與中醫(yī)的“正氣”有著緊密聯系，從現代免疫學角度闡述免疫治療與中醫(yī)“扶正消積”治法的關系研究已然越來越活躍[8]。國家級名老中醫(yī)韓明向教授遵循肺癌中醫(yī)學病機“整體正虛、局部積聚”，提出治療肺癌采用“益氣養(yǎng)陰、解毒消積、化痰祛瘀”的“扶正消積”方法，根據病機治法產生了治療肺癌的有效驗方QYSLD，此方后由安徽中醫(yī)藥大學李澤庚教授帶領的研究團隊不斷進行多次基礎研究并更新改良而最終形成。

Th細胞是T細胞亞群，在機體免疫中有重要功能，是機體內一類重要的免疫調節(jié)細胞，根據分泌出的細胞因子的不同主要將Th細胞分為Th1細胞與Th2細胞兩種。Th1細胞可以促進細胞免疫[9]，Th2細胞參與體液免疫應答以及抗體的生成[10]。生理狀態(tài)下，二者相對平衡，這是機體維持正常免疫功能重要條件之一，二者平衡失調，則機體免疫應答功能降低，進而使腫瘤免疫逃逸。

T細胞由多個免疫檢查點共同調控激活，而PD-1是其應答途徑中的一員，PD-1是由PD-1基因編碼的Ⅰ型跨膜糖蛋白，共有PD-L1和PD-L2 兩個配體，其中PD-L1是其主要配體[11]。PD-L1由于腫瘤細胞及其微環(huán)境的促進作用而過表達，PD-1/PD-L1信號通路進而激活，從而宿主的免疫反應被限制，適宜腫瘤生長的微環(huán)境也就形成，機體不能夠約束腫瘤細胞，致使其免疫逃逸[12]。PD-1/PD-L1抑制劑可以抑制PD-1/PD-L1信號通路，進而調節(jié)腫瘤生存環(huán)境，恢復T細胞對腫瘤的監(jiān)視和殺傷作用，提高了內源性抗腫瘤的免疫應答功能[13]，最終發(fā)揮抗腫瘤作用。