基于網絡藥理學和分子對接技術探討四妙消痹湯治療類風濕關節炎的作用機制*

許博，馬俊福，鄭福增，趙晶晶

1.河南中醫藥大學，河南 鄭州 450046； 2.河南省中醫院，河南 鄭州 450000

類風濕關節炎是以患者關節活動受限和畸形為主要癥狀的自身免疫性疾病，在中醫學中屬“尪痹”范疇。目前，治療類風濕關節炎的常用藥物分為四大類，即非甾體類抗炎藥(nonsteroidal antiinflammatory drugs，NSAIDs)、改善病情的抗風濕藥(disease-modifying anti-rheumatic drugs，DMARDs)、糖皮質激素和植物藥[1]。但這些常用治療藥物大多存在不良反應且需要長期服用以維持療效，給患者生活帶來較大困擾。

四妙消痹湯由金銀花、玄參、當歸、甘草、白花蛇舌草、山慈菇、豨薟草、虎杖、白芍、土茯苓和威靈仙組成，方中金銀花清熱解毒、疏散風熱，具有抗炎、免疫調節的作用[2]；玄參滋陰、降火、生津、涼血、解毒，具有抗炎、抗菌功效[3]；當歸補血活血、調經止痛，具有抗炎鎮痛、抗氧化作用[4]；甘草補脾益氣、緩急止痛、緩和藥性、調和諸藥，具有抑菌、抗腫瘤的作用[5]；白花蛇舌草清熱解毒、利尿消腫、活血止痛，具有抗菌消炎、抗腫瘤作用[6]；山慈菇清熱解毒、化痰散結[7]；豨薟草祛風濕、通絡利筋骨、益肝腎[8]；虎杖清熱解毒、利濕退黃、散瘀止痛、化痰止咳[9]；白芍平肝止痛、養血調經、斂陰止汗[10]；土茯苓祛風濕、利關節、解毒、鎮痛、抗菌[11]；威靈仙祛風濕，通經絡，止痛，消骨鯁[12]，諸藥共用，起到利濕通痹、柔筋利節、清熱解毒、活血止痛的功效。

四妙消痹湯在臨床常被用來治療類風濕關節炎，但其作用機理鮮有研究，本研究基于網絡藥理學進行討論分析，旨在探索四妙消痹湯治療類風濕關節炎的具體作用機制，為后續藥物治療提供思路。

1 資料與方法

1.1 四妙消痹湯組方中藥活性成分及其作用靶點篩選通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP，https：//tcmsp-e.com/)進行檢索并以化合物口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%及類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18為標準篩選獲得四妙消痹湯中11味中藥的有效成分及其相關靶點，再通過uniprot數據庫對藥物有效成分相關靶點進行名稱規范，并獲得其簡稱。

1.2 類風濕關節炎疾病靶點及四妙消痹湯治療類風濕關節炎潛在靶點的獲取通過GeneCards數據庫(https：//www.genecards.org/)、在線人類孟德爾遺傳(online mendelian inheritance in man，OMIM，https：//www.omim.org/)數據庫、藥物基因組學知識庫(pharmacogenomics knowledgebase，PharmGKB，https：//www.pharmgkb.org/)、藥物靶標數據庫(therapeutic target database，TTD，http：//db.idrblab.net/ttd/)、DrugBank數據庫(https：//go.drugbank.com/)搜索類風濕關節炎相關疾病靶點，將5個數據庫獲得的靶點信息導入R語言，排除重復靶點。利用R語言將藥物有效成分相關靶點與類風濕關節炎相關靶點進行映射，得到的重復靶點即為四妙消痹湯治療類風濕關節炎的潛在靶點，并據此繪制Venn圖。

1.3 蛋白質相互作用(protein-protein interaction，PPI)網絡將四妙消痹湯治療類風濕關節炎的潛在靶點導入STRING(https：//cn.string-db.org/)在線分析平臺，蛋白種類種屬設置為“Homo sapiens”并設置最低相互作用閾值>0.95，其他設置保持默認，獲得PPI網絡。利用Cytoscape軟件中的CytoNCA插件對PPI網絡進行拓撲分析，篩選得到核心靶點。

1.4 基因本體(gene ontology，GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)信號通路富集分析利用R語言和BiocManager中的數據包將四妙消痹湯治療類風濕關節炎的潛在靶點轉換為基因ID。再使用R軟件中的數據包和相關函數進行GO功能富集分析和KEGG信號通路富集分析，并將富集分析結果中前20條進行可視化。

1.5 分子對接根據PPI網絡拓撲分析結果，結合文獻查閱，選取3個核心靶點及3個藥物有效成分進行分子對接。在PubChem(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)數據庫中搜索藥物有效成分2D結構，再利用ChemBio3D Ultra 14.0軟件轉化為3D結構；通過PDB(RCSB PDB：Homepage https：//www.rcsb.org/)數據庫下載核心靶點的蛋白結構并利用PyMOLWin軟件對蛋白結構進行簡化。將藥物有效成分3D結構和核心靶點蛋白結構數據導入AutoDockTools-1.5.6軟件得到活性口袋數據，通過R語言運用Vine進行分子對接并利用PyMOLWin.exe軟件進行可視化。

2 結果

2.1 四妙消痹湯組方中藥活性成分及其作用靶點篩選通過TCMSP檢索獲得四妙消痹湯中11味中藥的有效成分190個，其中白花蛇舌草7個、白芍13個、當歸2個、甘草92個、虎杖10個、金銀花23個、山慈菇3個、土茯苓15個、威靈仙7個、豨薟草9個、玄參9個。通過TCMSP檢索190個有效成分的相關靶點，去重后共得到215個。

2.2 四妙消痹湯治療類風濕關節炎的潛在作用靶點通過GeneCards、OMIM、PharmGKB、TTD及DrugBank數據庫搜索類風濕關節炎相關疾病靶點，刪除重復靶點后共得到2 971個類風濕關節炎相關靶點，如圖1。利用R語言將藥物有效成分相關靶點與類風濕關節炎相關靶點進行映射，得到重復靶點151個，即為四妙消痹湯治療類風濕關節炎的潛在靶點，如圖2。

圖1 類風濕關節炎相關靶點信息

圖2 四妙消痹湯與類風濕關節炎共同靶點

2.3 PPI網絡將四妙消痹湯治療類風濕關節炎的潛在靶點導入STRING在線分析平臺，得到PPI網絡，如圖3。同樣將數據導入Cytoscape3.8.0得到圖4A。利用Cytoscape3.8.0中的CytoNCA插件進行拓撲分析，依據Betweenness、Closeness、Degree、Eigenvector、LAC、Network 6個參數的中位值為標準，篩選得到關鍵靶點，見圖4B。以相同的標準對關鍵靶點進行再次篩選后得到核心靶點基因11種，包括JUN、MAPK1、FOS、TP53、ESR1等，圖4C。

圖3 PPI網絡

注：A：PPI網絡；B：關鍵靶點PPI網絡；C：核心靶點PPI網絡圖4 核心靶點PPI網絡

2.4 GO功能富集分析與KEGG信號通路富集分析采用R語言對四妙消痹湯治療類風濕關節炎的潛在靶點進行GO功能富集分析，其中包括生物學過程、分子功能和細胞組分。生物學過程主要包括對脂多糖的反應(response to lipopolysaccharide)、對細菌來源分子的反應(response to molecule of bacterial origin)、細胞對化學應激的反應(cellular response to chemical stress)、對金屬離子的反應(response to metal ion)、對氧化應激的反應(response to oxidative stress)等；細胞組分主要包括膜筏(membrane raft)、膜微區(membrane microdomain)、轉錄調節復合物(transcription regulator complex)、轉移酶復合物(transferase complex)、蛋白激酶復合物(protein kinase complex)等；分子功能包括DNA-結合轉錄因子結合(DNA-binding transcription factor binding)、RNA聚合酶Ⅱ-特異性DNA轉錄因子結合(RNA polymerase Ⅱ-specific DNA-binding transcription factor binding)等，如圖5。采用R語言對四妙消痹湯治療類風濕關節炎的潛在靶點進行KEGG信號通路富集分析，根據P<0.05，篩選出172條信號通路，主要為脂質和動脈粥樣硬化(lipid and atherosclerosis)、晚期糖基化終末產物(advanced glycation end product，AGE)-AGE受體(the receptor of AGE，RAGE)信號通路在糖尿病并發癥中的作用(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、乙型肝炎(hepatitis B)、流體剪切應力與動脈粥樣硬化(fluid shear stress and atherosclerosis)、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染(kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection)等，如圖6。

圖5 GO富集分析氣泡圖

圖6 KEGG富集分析氣泡圖

2.5 分子對接結果根據PPI網絡拓撲分析及相關文獻，選取HSP90AA1、JUN及RELA 3個核心靶點與山柰酚(kaempferol)、毛地黃黃酮(luteolin)及槲皮素(quercetin)3個藥物有效成分進行分子對接發現，藥物有效成分與核心靶點之間能相互結合并有較好的親和力。見圖7、表1。

注：A：HSP90AA1與kaempferol；B：HSP90AA1與luteolin；C：HSP90AA1與quercetin；D：JUN與kaempferol；E：JUN與luteolin；F：JUN與quercetin；G：RELA與kaempferol；H：RELA與luteolin；I：RELA與quercetin圖7 藥物有效成分與核心靶點分子對接示意圖

表1 藥物有效成分與核心靶點分子對接結果 (kcal·mol-1)

3 討論

類風濕關節炎是一種常見慢性疾病，其活動期癥狀往往表現為關節疼痛、腫脹變形，嚴重者會導致關節畸形和功能喪失，多見于中年女性[13]。《千金要方》中提到“熱毒流于四肢，歷節腫痛”，據此采用清熱解毒、通痹止痛的治療方法，四妙消痹湯具有清熱解毒、活血止痛、通痹利濕的功效，因此，臨床上常采用四妙消痹湯治療活動期類風濕關節炎，具有較好的療效[14]，且不良反應較少，具有較高的臨床價值[15]。

本研究利用網絡藥理學對四妙消痹湯治療類風濕關節炎的藥理學機制進行研究，篩選出四妙消痹湯主要活性成分為豆甾醇、槲皮素、山柰酚、甘草寧B、β-谷甾醇、芍藥苷、兒茶素、華良姜素、異鼠李素、木樨草素等。研究表明，豆甾醇可通過刺激網狀內皮系統增生，加強巨噬細胞能力，從而發揮抗炎作用[16]。槲皮素可有效抑制分泌多種致炎分子的環氧合酶-2(cyclooxygenase 2，COX-2)促進子的轉錄活性，同時能夠刺激細胞增殖[17]，還能通過降低中性粒細胞對炎癥因子的敏感性從而達到抗炎的作用[18]。山柰酚可以通過抑制炎癥因子一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)、COX-2及C-反應蛋白 (C-reaction protein，CRP)等的表達發揮抗炎作用[19]，且高劑量山柰酚還可通過調節鈣離子代謝平衡，促進骨膠原生成[20]。研究表明，山柰酚可通過抑制黃嘌呤氧化酶活性減少體內黃嘌呤生成尿酸，從而降低高尿酸血癥和痛風[21]，還可通過降低氧化低密度脂蛋白誘導的B類清道夫受體CD36mRNA表達保護低密度脂蛋白的氧化，通過抑制巨噬細胞對氧化低密度脂蛋白的攝取防止動脈粥樣硬化的發生[22]。劉慧瓊等[23]通過對豬油的抗氧化實驗發現，β-谷甾醇是一種良好的抗氧化劑，具有很好的清除自由基的能力，由于自由基與衰老、炎癥、休克、動脈粥樣硬化、藥物及酒精中毒等有關，β-谷甾醇還可作為外源性氧自由基清除劑。芍藥苷可通過調節糖原合成酶激酶3β和核因子-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)信號通路降低β-淀粉樣蛋白誘導的膠質細胞和星形膠質細胞活性從而達到下調促炎因子表達和上調抗炎因子表達的效果[24]。曾亮等[25]通過抑菌環實驗證明了兒茶素對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌都有抑制作用。研究表明，木樨素通過抑制DNA拓撲異構酶活性影響菌體核酸和蛋白質合成，具有明顯的抑菌活性，且在0.30～9.75 mg·L-1濃度范圍內可明顯抑制柯薩奇B3病毒引起的細胞病變，具有體外抗柯薩奇B3病毒的作用[26-27]。此外，木樨草的抗炎作用可能與其抑制核內NF-κB的表達和降低DNA結合活性從而下調COX-2蛋白的表達有關[28]。

PPI網絡拓撲分析可知，四妙消痹湯治療類風濕關節炎主要靶點為CCND1、FOS、MAPK3、ESR1、JUN。研究發現，宮頸癌癌變組織中CCND1呈高表達，具有促癌作用，沉默CCND1基因表達可抑制宮頸癌的發生發展并提高化療敏感性[29]。鮑亮等[30]研究發現，ESR1基因多態性與膝骨關節炎發病有一定聯系，ESR1基因突變可能會增加膝骨關節炎患病風險。核心靶點GO功能富集分析和KEGG信號通路富集分析發現，四妙消痹湯治療類風濕關節炎主要涉及的通路有脂質和動脈粥樣硬化、AGE-RAGE信號通路在糖尿病并發癥中的作用、IL-17信號通路、TNF信號通路、流體剪切應力與動脈粥樣硬化、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染等。大量實驗和臨床證據表明，在自身免疫性疾病和炎性病變中都有 IL-17 的參與，且在誘導自身免疫反應和炎癥病變的過程中IL-17起到了重要的調節因子的作用[31]。姜瑞雪等[32]研究發現，固本健腦方改善老年健忘大鼠記憶功能的分子機制與AGE-RAGE信號通路密切相關。JUN家族成員包含c-JUN、JUNB和JUND[33]，研究發現，植物乳桿菌NCU116通過c-JUN信號通路促進結腸黏膜穩態和Muc2基因表達[34]。在分子對接中，一般認為配體與受體分子的構象穩定時，其能量越低，發生作用的可能性越大，因此根據分子對接結果顯示山柰酚、毛地黃黃酮、槲皮素與JUN結合度最好，山柰酚是一種天然的免疫抑制劑，可減少由于T淋巴細胞過度活化和增殖所導致的自身免疫病和器官移植排斥反應的發生，毛地黃黃酮(木樨草素)能通過降低炎癥因子轉錄調節因子的活性減少促炎細胞因子和炎癥介質的產生[35]，槲皮素能夠通過降低中性粒細胞對炎癥因子的敏感性達到抗炎效果[18]，JUN(c-JUN)通過調節腫瘤抑制因子PTEN的表達促進細胞生存[36]。

綜上所述，四妙消痹湯治療類風濕關節炎具有多成分、多靶點、多途徑的特點，為臨床應用治療提供了科學依據，也為探索新的治療方法提供思路。