生脈湯HPLC指紋圖譜的建立及質量控制*

李明明，朱志軍，黨曉月，李航飛

河南中醫藥大學藥學院，河南 鄭州 450046

生脈湯源自金代張元素的《醫學啟源》，書中記載人參、麥冬、五味子3味藥，長流水煎，即得生脈湯。方中人參大補元氣、生津復脈、補脾益肺，佐以麥冬，養陰潤肺、益胃生津，五味子收斂固澀、益氣生津止渴。三藥“一補一潤一斂”，行益氣復脈、斂陰止汗、生津止渴之效，用于治療氣陰兩虛證。臨床研究表明生脈制劑應用廣泛，對心血管疾病、呼吸系統疾病、內分泌系統疾病、消化系統疾病、神經精神系統疾病、腫瘤等均具有良好的治療作用[1-2]。生脈湯中主要成分為皂苷類、黃酮類、木脂素類、多糖類、有機酸類等[3-4]，具有治療糖尿病[5]、心力衰竭[6]、休克[7]、肺氣腫[8]、支氣管哮喘[9]、肝炎[10]、便秘[11]、心肌病[12]、抑郁癥[13]等多種藥理活性。木脂素類作為生脈方中第二大類有效成分，具有抗病毒、抗焦慮、抗癲癇、抗驚厥、鎮靜催眠、抗抑郁、抗衰老、抗腫瘤、護肝、抗菌和保護神經細胞，改善記憶力等功效[14-15]。

皂苷類成分水溶性差，并且在高濕熱和偏酸性的條件下易分解[16]，因此采用傳統湯劑的制備方法，皂苷類成分含量較低。有研究表明，生脈方中五味子的木脂素類成分能夠促進人參皂苷類成分的攝入，并降低人參皂苷的排出率，從而使細胞內人參皂苷的濃度增加[16]。因此五味子與人參配伍使用能增強人參的藥效，由此可見木脂素類成分在生脈湯中含量較多且作用關鍵。目前對于該方傳統湯劑的研究主要聚集在臨床方面，其質量控制研究較少。基于以上原因，本研究以五味子醇甲峰為參照峰建立了傳統方劑生脈湯的指紋圖譜，確認了13個共有峰，并指認了五味子中3種木脂素類成分，結合相似度評價、主成分分析、聚類分析和正交偏最小二乘判別分析等化學計量方法，對10批生脈湯的質量進行綜合評價，為生脈湯的質量控制提供有效的方法依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器Agilent Technologies 1260高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)、METTLERAE 240 十萬分之一天平(德國梅特勒公司)、PTHW型調溫電熱套(鞏義市英峪予華電熱儀器廠)、UPH-II-107優普超純水機(成都優普超純科技有限公司)、KQ-500 DV型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)、HH-2型數顯恒溫水浴鍋(金壇市杰瑞爾電器有限公司)。

1.2 材料對照品五味子醇甲(18022702，純度≥98%)、五味子甲素(18032609，純度≥98%)、五味子乙素(17052105，純度≥98%)，均由四川省維克奇生物科技有限公司提供；人參飲片購于盛實百草藥業有限公司(A170128001)，麥冬飲片購于浙江桐君堂中藥飲片有限公司(180508)，五味子購于安徽協和成藥業飲片有限公司(18042612)；D 101大孔吸附樹脂(天津市光夏精細化工研究所)，甲醇、乙腈均為色譜純(安徽天地高純溶劑有限公司)。生脈湯(實驗室自制)生產批號依次為20191025、20191027、20191028、20191030、20191101、20191102、20191104、20191106、20191107、20191109。

2 方法與結果

2.1 色譜條件色譜柱：Diamonsil C18(L)(4.6 mm×250.0 mm)；流動相：乙腈(A)-水(B)；梯度洗脫(0-10 min，20%→22%A；10-30 min，22%→28%A；30-45 min，28%→40%A；45-75 min，40%→62%A；75-100 min，62%→80%A)；流速：1.0 mL·min-1；進樣量：5 μL；柱溫：30 ℃；檢測波長：203 nm[17]。

2.2 對照品溶液的制備分別精密稱取五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素對照品，加甲醇定容至 5 mL，配制成濃度分別為0.384 g·L-1、0.040 g·L-1、0.024 g·L-1的五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備稱取人參5 g，麥冬10 g，五味子5 g，分別粉碎，混合，加入適量蒸餾水煎煮，過濾，濾液濃縮至50 mL，緩慢加入200 mL無水乙醇，邊加邊攪拌，過濾，濾液濃縮至50 mL，取10 mL濃縮液過D101大孔吸附樹脂柱，用6.6 BV蒸餾水洗雜后，再用5.9 BV 70%的乙醇洗脫，收集洗脫液，于60 ℃水浴蒸干，加甲醇溶解定容至10 mL，過0.22 μm微孔濾膜，濾液作為供試品溶液，備用。

2.4 生脈湯HPLC指紋圖譜的建立

2.4.1 方法學考察

2.4.1.1 精密度實驗取2.3項下生脈湯供試品溶液適量，按2.1項下的色譜條件連續進樣6次，以五味子醇甲為參照峰，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果13個共有峰相對保留時間的RSD值均<0.30% (n=6)，相對峰面積的RSD值均<3.20% (n=6)，表明儀器的精密度良好。

2.4.1.2 穩定性實驗取2.3項下生脈湯供試品溶液適量，分別在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h按2.1項下的色譜條件進樣，以五味子醇甲為參照峰，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果13個共有峰相對保留時間的RSD值均<0.04% (n=6)，相對峰面積的RSD值均<4.60% (n=6)，表明生脈湯供試品溶液在24 h內穩定。

2.4.1.3 重復性實驗取處方量藥材，按2.3項下方法制備6份生脈湯供試品溶液，按2.1項下的色譜條件進樣，以五味子醇甲為參照峰，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果13個共有峰相對保留時間的RSD值均<0.09% (n=6)，相對峰面積的RSD值均<4.90% (n=6)，表明生脈湯樣品溶液重復性良好。

2.4.2 指紋圖譜的建立按2.3項下方法制備10批生脈湯供試品溶液，按2.1項下的色譜條件進樣測定，記錄10批生脈湯樣品的色譜圖，然后將10批生脈湯供試品溶液的指紋圖譜數據導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2004A版)，生成10批生脈湯HPLC指紋圖譜的對照圖譜R，以S1號色譜圖為參考，時間窗寬度設為0.4 min，進行多點校正和自動匹配，建立生脈湯劑的指紋圖譜，結果如圖1。

圖1 10批生脈湯指紋圖譜

2.4.3 相似度評價將10批生脈湯供試品溶液的指紋圖譜數據導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2004A版)，計算相似度，結果見表1。10批生脈湯供試品溶液的指紋圖譜的相似度均≥0.980。表明藥材質量均一、穩定以及實驗方法穩定可靠。

表1 10批生脈湯指紋圖譜相似度評價結果

2.4.4 共有峰的確定及相關分析結合色譜峰分離情況與對照圖譜R，10批樣品共標定了13個共有峰，通過與對照品色譜圖比對，指認出3個成分，分別為2號色譜峰(五味子醇甲)、12號色譜峰(五味子甲素)和13號色譜峰(五味子乙素)，結果如圖2。以峰面積較大和分離度較好的五味子醇甲色譜峰為參照峰(S)，計算各特征峰的保留時間和保留峰面積與同一圖譜中S1峰的保留時間和保留峰面積的比值，得到10批生脈湯樣品共有峰相對保留時間RSD為0.000%～0.067%，相差較小，相對峰面積RSD為0.000%～4.220%，結果如表2、表3所示。說明不同批次藥材之間，成分含量稍有差異。

注：a：五味子醇甲；b：五味子甲素；c：五味子乙素圖2 對照品和樣品疊加圖譜

表2 10批生脈湯指紋圖譜共有峰相對保留時間

表3 10批生脈湯指紋圖譜共有峰相對峰面積

2.4.5 聚類分析以13個共有峰的峰面積為變量，導入SPSS26.0軟件，以組間聯結法結合平方歐氏距離進行聚類分析，繪出樹狀圖，結果如圖3，當分類距離為10時，10批樣品可聚為2類，S1、S3、S8、S10樣品聚為一類，S2、S4、S5、S6、S7、S9樣品聚為一類。說明不同批次之間存在一定的差異性。

圖3 10批生脈湯樣品聚類分析圖

2.4.6 主成分分析運用SPSS26.0 軟件，以10批生脈湯樣品指紋圖譜的13個共有峰峰面積為變量，對其進行主成分分析，提取2個主成分，結果前兩個主成分的方差貢獻率分別為91.366%、0.359%，累計方差貢獻率達到94.126%，如表4所示。得分系數矩陣見表5，由結果可知2號色譜峰(五味子醇甲)、4號色譜峰和9號色譜峰對主成分1的貢獻較大，5號色譜峰、6號色譜峰和13號色譜峰(五味子乙素)對主成分2的貢獻較大。以13個共有峰的峰面積為變量，導入SIMCA-P14.1軟件，建立PCA模型，共提取2個主成分，模型解釋率R2X為0.979，預測力Q2為0.852，均>0.5，說明建立的模型具有較高的穩定性和預測率，能夠識別樣品組間差異，PCA得分圖見圖4，其分類結果與聚類分析結果基本一致，10批樣品分為兩類，S1、S3、S8、S10樣品分布在左側，其余的樣品分布在右側。

表4 生脈湯主成分特征值及方差貢獻率

表5 生脈湯主成分得分系數矩陣

圖4 10批生脈湯主成分分析得分圖

2.4.7 正交偏最小二乘判別分析為找出10批樣品的組間差異及差異成分，將10批生脈湯樣品共有峰的峰面積導入SIMCA-P14.1軟件進行正交偏最小二乘判別分析，得分矩陣圖如圖5。結果表明10批樣品聚為兩類，S1、S3、S8、S10聚為一類，S2、S4、S5、S6、S7、S9聚為一類，與聚類分析和主成分分析結果一致。通過VIP值篩選出影響生脈湯成分差異的標志性成分，結果見圖6。以 VIP 值>1為篩選標準，標記出3個貢獻較大的成分，依次為2號峰(五味子醇甲，VIP值為2.473 44)、10號峰(VIP值為1.262 32)、7號峰(VIP值為1.197 69)，以上3種成分對生脈湯成分含量上的差異影響較大，因此在控制生脈湯質量時可以此3種成分為參考。

圖5 10批生脈湯樣品正交偏最小二乘判別分析得分圖

圖6 10批生脈湯正交偏最小二乘判別分析VIP值圖

3 討論

本研究在生脈湯指紋圖譜的建立過程中分別考察了提取純化方法(水飽和正丁醇萃取、大孔吸附樹脂純化、70%乙醇超聲)、流動相(甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.05%磷酸溶液)、柱溫(25 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃、35 ℃、40 ℃)、流速(0.7 mL·min-1、0.8 mL·min-1、0.9 mL·min-1、1.0 mL·min-1)、進樣量(5 μL、10 μL、15 μL)等影響因素，最終確定以乙腈(A)-水(B)為流動相，梯度洗脫，流速為1.0 mL·min-1，柱溫為 30 ℃，進樣5 μL，檢測波長203 nm為色譜條件。在本實驗確定的條件下，指紋圖譜基線平穩，分離度和峰形良好，具有較好的重復性和穩定性。

對10批生脈湯指紋圖譜進行聚類分析，結果顯示當分類距離為10時，10批生脈湯樣品可分為兩類；主成分分析結果顯示2號峰(五味子醇甲)、4號峰、5號峰、6號峰、9號峰和13號峰(五味子乙素)對生脈湯的主要成分影響較大，PCA得分圖結果與聚類分析結果基本一致，將10批生脈湯指紋圖譜分為兩類；正交偏最小二乘判別分析顯示VIP值>1的2號色譜峰(五味子醇甲)、10號色譜峰和7號色譜峰成分為決定生脈湯質量的主要差異性成分，其得分矩陣圖的分類結果與聚類分析一致。將10批生脈湯樣品分為兩類，說明10批樣品之間有相似性的同時也具有一定的差異性。

人參和麥冬中均有皂苷類成分，曾嘗試對該制備方法下的生脈湯指紋圖譜中皂苷類成分進行比對，但由于水溶性差，且在濕熱環境下不穩定[17-18]，易轉化為其他成分；并且其轉化比率與pH值相關，在酸性條件下更容易使皂苷發生水解，在生脈湯處方中，五味子含有大量的有機酸[19-20]和氨基酸[21]類物質，使湯劑的整體pH值降低，促進了皂苷類成分水解；《中華人民共和國藥典》中生脈飲的制備方法為用65%的乙醇滲漉，最終只以五味子醇甲的含量作為指標。在本實驗樣品制備的過程中，先后用蒸餾水和70%乙醇對水提液進行洗脫作為生脈湯供試品溶液，與生脈飲的制備方法有相似之處，故可能會導致皂苷類成分的部分流失，使在本實驗的方法條件下制備的樣品中皂苷類成分含量相對較低。

本實驗結合化學計量學的分析方法建立了10批生脈湯的指紋圖譜，整體均一性良好、質量穩定，且該方法簡便、可靠，可以通過控制生脈湯指紋圖譜整體相似度和圖譜中2號色譜峰(五味子醇甲)、10號色譜峰和7號色譜峰成分來全面評價生脈湯質量，保障生脈湯臨床用藥的有效性。