基于eNOS/NO信號通路探討腦清通顆粒對肝熱痰瘀證高血壓大鼠的作用*

嚴亞鋒，白海俠，周海哲

陜西中醫藥大學，陜西 咸陽 712046

高血壓是最常見的心腦血管疾病之一，也是心腦血管病的首要危險因素，長期高血壓會損害心、腦、腎等器官。研究表明，高血壓的發病機制主要涉及血管內皮功能紊亂、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(rein-angiotensin-aldosterone-system，RAAS)失衡、交感神經系統激活、血管平滑肌細胞增殖、炎性反應等[1-2]，其中，內皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS) /一氧化氮(nitric oxide，NO)信號通路與高血壓的發病機制密切相關[3-5]。腦清通顆粒是首屆國醫大師張學文教授多年臨床實踐凝練的經驗方，處方包括決明子、丹參、川芎、 姜半夏等11味中藥，具有清肝活血、滌痰通絡的功效，主要用于治療肝熱痰瘀證高血壓、中風病、頭痛等[6]。課題組前期研究表明，腦清通顆粒治療肝熱痰瘀證高血壓療效確切[7-8]，但降壓機制尚不清楚。本研究基于eNOS/NO信號通路探討腦清通顆粒對肝熱痰瘀證高血壓大鼠的作用機制。

1 材料

1.1 動物70只6周齡SPF級雄性SD大鼠，體質量(200±10)g，由成都達碩實驗動物有限公司提供，生產許可證號：SCXK(川)2020-030，合格證號：0043221。所有大鼠均分籠給予標準飼料適應性喂養1周，室溫(22±2)℃，晝夜各12 h，自由飲水進食。本實驗方案經陜西中醫藥大學動物實驗倫理委員會審批通過，倫理批準號為：SUCMDL20210316001。

1.2 藥物與試劑腦清通顆粒(陜西中醫藥大學附屬醫院制劑中心，規格：15 g/袋，批號：200601)；卡托普利片(山西津華暉星制藥有限公司，規格：25 mg/片，批號：200104)；丙硫氧嘧啶片(上海朝暉藥業有限公司，批號：1903N04)；黑順片配方顆粒(四川新綠色藥業科技發展有限公司，批號：200902)。環孢菌素A(上海源葉生物科技有限公司，批號：S17068)；注射用大豆油(浙江田雨山藥用油有限公司，批號：19210KG)；二氨基聯苯胺(3，3′-diaminobenzidine，DAB)試劑盒(丹麥DAKO公司，貨號：K5007)；辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標記山羊抗兔IgG抗體、RIPA裂解液、eNOS多克隆抗體、BCA蛋白濃度測定試劑盒、ECL試劑盒(武漢賽維爾生物科技有限公司，貨號：GB23303、G2002、GB11086、G2014、G2026)；血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)、內皮素-1(endothelin-1，ET-1)、eNOS試劑盒[艾萊薩生物科技(上海)有限公司，批號均為202101]；NO測定試劑盒(微板法，南京建成生物工程研究所，貨號：A013-2-1)；精煉豬油(臨沂經濟技術開發區裕升食用油有限公司)；膽固醇、膽酸鈉、吐溫-80、丙二醇(河南萬邦化工科技有限公司)。

1.3 儀器BP-300A型全自動大小鼠無創血壓測量系統(成都泰盟軟件有限公司)；RM2016型病理切片機(上海徠卡儀器有限公司)；A1型研究級正置數碼顯微鏡(德國Zeiss公司)；DYCZ-24DN型電泳儀、DYCZ-40D型轉膜儀(北京六一儀器廠)；Image J 1.8.0圖像分析系統(美國國立衛生研究院)。

2 方法

2.1 高脂乳劑配制取80 g豬油、40 g膽固醇置500 mL燒杯中，加熱融化后加入8 g膽酸鈉和4 g丙基硫氧嘧啶，充分攪勻，加入80 mL吐溫-80、120 mL 丙二醇及適量的蒸餾水，充分攪勻后加蒸餾水定容至400 mL并充分混勻，置4 ℃冰箱保存備用，用時加熱融化。

2.2 大鼠分組、模型制備及藥物干預隨機從70只6周齡SPF級雄性SD大鼠中選取10只為正常組，其余60只大鼠按參考文獻所述方法制備肝熱痰瘀證高血壓大鼠模型[6-7]，具體如下：采用環孢菌素A皮下注射加附子和高脂乳劑灌胃制備肝熱痰瘀證高血壓大鼠模型。測量大鼠基礎血壓后，以 5 mL·kg-1體積皮下注射25 mg·kg-1環孢菌素A后，以10 mL·kg-1體積灌胃給予高脂乳劑，最后以10 mL·kg-1體積灌胃給予2 g·kg-1附子溶液(黑順片配方顆粒溶液)，每日各1次，每種給藥間隔 1 h，連續給藥14 d。當大鼠尾部平均收縮壓(systolic blood pressure，SBP)與基礎血壓差值≥20 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)，且高于115 mm Hg者，即可判定為高血壓疾病模型建立成功[9]。當大鼠出現毛色晦暗、泛黃，易激惹，精神狀態不佳，飲食減少，口中痰涎增多，嘴唇、舌質紫暗，大便秘結等中的4項及以上者，即可判定為肝熱痰瘀證[10]。取造模成功的大鼠50只，隨機分為模型組、卡托普利組及腦清通顆粒低、中、高劑量組，每組10只。造模成功的第2天開始給予相應藥物灌胃，腦清通顆粒低、中、高劑量組大鼠分別灌胃給予1.3 g·kg-1、2.6 g·kg-1、5.2 g·kg-1的腦清通顆粒溶液，卡托普利組大鼠灌胃給予10 mg·kg-1的卡托普利溶液，正常組和模型組灌胃給予等體積生理鹽水，給藥體積 10 mL·kg-1，每日1次，連續給藥21 d。

2.3 大鼠動脈壓測定造模前3 d用大鼠血壓測量系統對大鼠進行血壓測量適應性訓練，以消除大鼠應激造成的血壓升高。于造模前、造模第7天、造模第14天、給藥第7天、給藥第14天和給藥第21天測量大鼠尾動脈壓，每只大鼠每次測量3次，取平均值，記錄平均動脈壓(mean arterial pressure，MAP)。

2.4 HE染色大鼠末次給藥后禁食不禁水12 h，用2%戊巴比妥鈉以40 mg·kg-1劑量腹腔注射麻醉大鼠。打開腹腔，腹主動脈取血后，打開胸腔，剝離剪取胸主動脈，用生理鹽水沖洗，剪取1 cm用4%多聚甲醛固定，石蠟切片，脫蠟至水(依次將切片放入二甲苯Ⅰ 20 min，二甲苯Ⅱ 20 min后采用梯度乙醇洗脫，最后用蒸餾水清洗)，HE染色，樹脂封片，在400倍光學顯微鏡下觀察血管內膜形態學變化。

2.5 血清AngⅡ、ET-1、eNOS、NO含量的檢測嚴格按照試劑盒說明書操作步驟，檢測大鼠血清中AngⅡ、ET-1、eNOS、NO的含量。

2.6 免疫組化檢測eNOS蛋白表達水平將石蠟切片脫蠟至水后進行抗原修復以阻斷內源性過氧化物酶的作用，加一抗(稀釋比例為1400)4 ℃孵育過夜后，再加入與一抗相應種屬的HRP標記二抗(稀釋比例為1200)，室溫孵育50 min，DAB顯色，蘇木素復染3 min，乙醇脫水，二甲苯透明，中性膠封片。在400倍光學顯微鏡下取5個視野，應用Image J軟件測定陽性表達產物的積分光密度值和陽性面積值，計算二者比值即為平均光密度值(mean optical density，MOD)，以此評估eNOS蛋白表達水平。

2.7 Western Blot檢測胸主動脈組織中eNOS蛋白表達水平剪取胸主動脈約60 mg置于勻漿管中，加入10倍體積RIPA裂解液，置于均質勻漿機中勻漿，勻漿后冰浴30 min，每隔5 min震蕩一次確保組織完全裂解。12 000 r·min-1離心10 min，收集上清液，用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白濃度。制作10%分離膠與5%濃縮膠，蛋白上樣后進行SDS-PAGE電泳分離蛋白。300 mA恒流轉膜30 min，將蛋白轉至PVDF膜，使用5%脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗(稀釋比例為11 000)，4 ℃孵育過夜；取出條帶，TBST洗滌3次，加入二抗(稀釋比例為15 000)室溫孵育30 min，TBST洗滌3次。按照ECL試劑盒說明書配制發光液，將條帶顯色。用PhotoShop整理去色，Alpha Innotech軟件處理系統分析目標條帶的光密度值。以β-actin為內參，使用Image J軟件進行灰度值檢測及分析。

3 結果

3.1 各組大鼠一般狀態比較正常組大鼠精神良好，毛色白凈、有光澤，舌質淡紅，口中無痰涎，飲食及兩便正常；模型組大鼠精神萎靡、易激怒，毛色晦暗、泛黃，舌質紫暗，口中多痰涎，飲食明顯減少，大便秘結；給予腦清通顆粒干預后，大鼠的精神狀態、毛色及舌質均有所好轉，口中痰涎減少，飲食及大便逐漸恢復正常。

3.2 各組大鼠MAP的比較造模前，各組大鼠MAP無明顯差異；造模后，與正常組比較，模型組大鼠MAP極顯著性升高(P<0.01)；給藥干預后，與模型組比較，腦清通顆粒低劑量組大鼠在給藥14 d后MAP極顯著性下降(P<0.01)；腦清通顆粒中、高劑量組大鼠在給藥7 d后MAP極顯著性下降(P<0.01)。結果表明，腦清通顆粒可降低肝熱痰瘀證高血壓大鼠的動脈血壓。見表1。

表1 腦清通顆粒對大鼠MAP的影響

3.3 腦清通顆粒對肝熱痰瘀證高血壓大鼠胸主動脈血管內膜的影響HE染色顯示，正常組大鼠血管內膜較光滑，結構較完整，未見明顯損傷，平滑肌細胞排列較整齊；而模型組大鼠血管內膜粗糙，結構不完整，有明顯脫落現象，平滑肌細胞數量明顯減少；腦清通顆粒各劑量組大鼠血管內膜損傷均得到不同程度改善，表明腦清通顆粒對血管內膜有保護作用。見圖1。

注：A：正常組；B：模型組；C：卡托普利組；D：腦清通顆粒低劑量組；E：腦清通顆粒中劑量組；F：腦清通顆粒高劑量組圖1 各組血管內膜形態組織學比較(HE染色，×400)

3.4 腦清通顆粒對肝熱痰瘀證高血壓大鼠血清 ET-1、AngⅡ、NO及eNOS水平的影響與正常組比較，模型組大鼠ET-1和AngⅡ水平極顯著性升高(P<0.01)，NO和eNOS水平極顯著性降低(P<0.01)；與模型組比較，腦清通顆粒各治療組 ET-1 和AngⅡ水平極顯著性降低(P<0.01)，NO水平極顯著性升高(P<0.01)；腦清通顆粒低劑量組eNOS水平顯著性升高(P<0.05)，腦清通顆粒中、高劑量組eNOS水平極顯著性升高(P<0.01)。結果表明，腦清通顆粒可降低肝熱痰瘀證高血壓大鼠血清中 ET-1 和AngⅡ水平，升高NO和eNOS水平。見表2。

表2 腦清通顆粒對肝熱痰瘀證高血壓大鼠血清ET-1、AngⅡ、NO及eNOS水平的影響

3.5 免疫組化法檢測腦清通顆粒對肝熱痰瘀證高血壓大鼠胸主動脈eNOS的影響與正常組比較，模型組大鼠胸主動脈中eNOS蛋白表達水平顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，腦清通顆粒各治療組大鼠胸主動脈eNOS蛋白表達水平極顯著升高(P<0.01)。結果表明，腦清通顆粒可提高肝熱痰瘀證高血壓大鼠胸主動脈eNOS的蛋白表達水平。見圖2、表3。

注：A：正常組；B：模型組；C：卡托普利組；D：腦清通顆粒低劑量組；E：腦清通顆粒中劑量組；F：腦清通顆粒高劑量組圖2 各組eNOS的蛋白表達比較(免疫組化染色，×400)

表3 免疫組化法檢測腦清通顆粒對肝熱痰瘀證大鼠胸主動脈eNOS的影響 值)

3.6 Western Blot法檢測腦清通顆粒對肝熱痰瘀證高血壓大鼠胸主動脈eNOS蛋白表達的影響與正常組比較，模型組大鼠胸主動脈eNOS蛋白表達水平極顯著性降低(P<0.01)；與模型組比較，腦清通顆粒各治療組大鼠胸主動脈eNOS蛋白表達水平極顯著性升高(P<0.01)。結果表明，腦清通顆粒可提高肝熱痰瘀證高血壓大鼠胸主動脈eNOS的水平。見圖3、表4。

注：A：正常組；B：模型組；C：卡托普利組；D：腦清通顆粒低劑量組；E：腦清通顆粒中劑量組；F：腦清通顆粒高劑量組圖3 各組eNOS蛋白表達條帶圖

表4 Western Blot檢測各組eNOS的蛋白表達水平

4 討論

高血壓病歸屬于中醫“眩暈”“頭痛”等范疇[11-12]，病機證型繁多，尚無統一標準[13]。各醫家對高血壓病認識各有不同，治法各異[14-16]。《素問·陰陽應象大論》曰：“人年四十，而陰氣自半也。”人至中老年易陰虛，陰虛也易致瘀，加上營養物質攝入普遍過多，體力勞動、運動等消耗性活動過少，脾失健運，痰濁內生，日久肝熱血瘀痰濁互結為患，臨床主要表現為頭痛、眩暈、血壓高、心煩急躁、大便秘結、舌質暗紅、舌下可見瘀點及瘀絲等。張學文教授認為多數高血壓病患者過食肥甘厚味，恣酒無度，多靜少動，勞心而不勞體，加之工作或學習壓力大，肝氣易郁滯，日久易化熱，肝熱煉液為痰，痰阻則血難行，血瘀則痰難化，痰滯日久必致血瘀，血瘀內阻，久必生痰，從而表現為肝熱痰瘀證高血壓病[17-19]。對于肝熱痰瘀證高血壓病，張教授常用具有清肝活血、滌痰通絡作用的腦清通顆粒治療，肝平熱清，痰去絡通，血行暢順，血壓乃降。本實驗通過環孢菌素A皮下注射加附子和高脂乳劑灌胃制備肝熱痰瘀證高血壓大鼠模型，結果發現，造模14天后大鼠血壓明顯升高，精神狀態差，易激惹，毛色晦暗、泛黃，飲食減少，口中痰涎增多，唇舌紫暗，大便秘結，表明肝熱痰瘀證高血壓模型制備成功。藥物治療21 d后，各治療組一般狀態基本恢復正常，血壓明顯降低，說明腦清通顆粒能降低肝熱痰瘀證高血壓大鼠血壓，使肝熱血瘀證大鼠癥狀基本恢復正常。HE染色結果顯示，經腦清通顆粒治療后，損傷的血管內膜得到了明顯改善，提示腦清通顆粒對血管內膜有保護作用。

高血壓的發病機制與eNOS的活性密切相關，eNOS通過催化左旋精氨酸生成NO[20-21]。NO是由內皮細胞釋放的最強血管舒張因子，可舒張動脈血管，降低血壓[22-23]。ET-1是內皮細胞釋放的血管收縮因子，與NO相互協調，共同調控血管的收縮舒張[24-25]。血管緊張素II(angiotensinⅡ，AngⅡ)是血管收縮因子，是RAAS系統的重要組成部分，可引起外周血管收縮和醛固酮分泌，導致血壓升高[26-27]。ET-1、AngⅡ、NO三者關系密切，相互影響，ET-1促進血管平滑肌細胞釋放AngⅡ，而AngⅡ又可誘導內皮細胞分泌ET-1；NO抑制ET-1的釋放，從而間接抑制AngⅡ的釋放[28]，相反，ET-1 的釋放增多，又反過來影響NO的釋放。本實驗研究發現，腦清通顆粒能降低肝熱痰瘀證高血壓大鼠血清ET-1和AngⅡ含量，提高血清NO和eNOS的含量，提高主動脈血管eNOS的蛋白表達水平，說明腦清通顆粒可抑制肝熱痰瘀證高血壓大鼠血液中血管收縮因子的釋放，促進血管舒張因子的釋放，從而引起血壓降低。

綜上所述，腦清通顆粒能夠保護肝熱痰瘀證高血壓模型大鼠血管內膜，舒張血管，降低血壓，其機制可能與抑制血管收縮因子ET-1和AngⅡ的釋放，促進血管舒張因子的釋放，激活eNOS/NO信號通路有關。