環狀非編碼A RNA及E ApoE基因對診斷腦卒中后血管性癡呆的價值研究

肖海萍,黃杰,謝偉賢,巫碧佳,歐衛謙,張普（廣東省佛山市第二人民醫院,廣東 佛山 528000）

血管性癡呆（VD）屬于精神系統常見疾患，近年來發病率呈現出升高的態勢，屬于慢性進行性疾病，對患者的生活質量與身心健康均產生較為嚴重的危害[1]。早期的干預治療能夠降低VD的發生，延緩VD的進展[2]。有研究認為，非編碼RNA（ncRNA）在VD的進展過程中起了主要作用，人類基因組有超過97%的轉錄產物為ncRNA，包括微小RNA（miRNA）、長鏈非編碼RNA（LncRNA）以及環狀RNA（circRNA），在生命活動中有著廣泛多樣的生物功能[3]。目前國內外關于circRNA的研究較多，研究結果亦表明其在腦血管病、帕金森病、癲癇等中樞神經系統疾患中存在差異性表達，circRNA有望成為相關疾患的生物學標志物，用于診斷及判斷預后[4]。有研究證實，AopE基因型與患者認知功能有關，參與神經系統的正常生長和損傷后的修復過程[5]。目前關于circRNA、LncRNA以及AopE在VD疾患中診斷效能的研究報道均較罕見，故本研究特對VD患者的circRNA、LncRNA以及AopE進行測定，旨在探究上述指標的診斷效能。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年7月-2021年12月佛山市第二人民醫院收治的VD患者100例和NVD患者100例。納入標準：①確診為缺血性腦卒中；②發病時間＜24h；③患者年齡≤79歲；④患者及家屬知情同意。排除標準：①患有阿爾茲海默癥疾患或精神系統疾患；②既往有腦卒中或腦外傷病史；③合并自身免疫性疾患；④腦干梗死或大面積腦梗死。VD組男62例，女38例，年齡50-81歲，平均（65.85±5.64）歲，腦梗死部位：基底節區55例，腦葉20例，腦干15例，其他10例，合并高血壓34例，糖尿病40例，高血脂28例，吸煙15例，受教育年限2-21年，平均（12.15±3.80）年。NVD組男6 5 例，女3 5 例，年齡5 1-8 2 歲，平均（65.86±6.68）歲，腦梗死部位：基底節區56例，腦葉22例，腦干17例，其他5例，合并高血壓36例，糖尿病38例，高血脂30例，吸煙18例，受教育年限3-22年，平均（12.09±3.64）年。另選擇同期健康體檢者100例作為對照組，其中男67例，女33例，年齡52-79歲，平均（65.53±6.09）歲，吸煙20例，受教育年限2-22年，平均（12.31±3.51）年。三組上述資料比較具有均衡性（P＞0.05），可行比較。本研究已獲得醫院倫理委員會審批。

1.2 方法

1.2.1 AopE 無菌收集受試者靜脈血5ml，EDTANa2抗凝，按常規方法提取外周血白細胞基因組DNA，用于進行聚合酶鏈式反應（RCR），方法為PCR熒光探針法。從冰箱中取出試劑盒，平衡至室溫，各組充分融解，快速離心10s。核算本次實驗所需的反應數，按照23μl/孔分裝量將每種反應液分別裝到反應管內，PCR反應管轉移至樣本區，剩余試劑放回-20℃±5℃冰箱中冷凍避光保存。提取樣本DNA，使用天根血液基因組DNA提取試劑盒（TIANamp Blood DNA Kit DP318）進行血液基因組DNA的提取，所提取的DNA需要用紫外線分光光度計測定濃度及純度，使得DNA的A260/280在1.8-2.0。將待測樣本的基因組DNA、空表對照、弱陽性對照分別加入已裝有4種PCR反應液的反應管中，加入量為2μl/孔，待測樣本的基因組DNA濃度為5-15ng/μl。蓋好PCR反應管蓋，記錄樣本加樣情況。將PCR反應管轉移到核酸擴增區進行上機檢測。若PCR反應管內加入模板后遇到臨時情況不能立即上機，需將加好模板的PCR反應管放于2℃-8℃條件下暫時保存，并在24h內盡快上機進行檢測。將PCR反應管放置在儀器樣品上開始進行PCR擴增，記錄好放置順序。開始進行PCR擴增，反應結束后根據擴增曲線，劃定合適基線（一般起始設定為3，終止設定為15）和熒光閾值（一般將閾值劃定在擴增曲線對數形式下指數增長期的中間），得到不同通道Ct值并按照相應的表進行結果判定。

1.2.2 LncRNA 抽取空腹靜脈血5ml于EDTANa2抗凝，分離血清，并用2個新的EP管分裝，于-80℃冰箱中保存。取出EP管解凍，加入Trizol試劑，顛倒混勻后再加入氯仿，劇烈震蕩，離心取上層無色液體至新EP管，加入異丙醇混勻離心棄上清液后加入焦碳酸二乙酯溶解，參照逆轉錄試劑盒準備逆轉錄制備cDNA，使用PCR進行測定。

1.2.3 circRNA 抽取空腹靜脈血5ml于EDTANa2抗凝，在3000r/min的速率下離心10min，用Agilent Human circRNA芯片做檢測與分析，下一步進行總RNA提取，并對芯片篩查結果做PCR驗證。

1.2.4 認知功能評分 缺血性腦卒中患者治療3個月后對VD組患者進行認知功能評分，采用簡明精神狀態量表（MMSE）進行，總分30分，輕度（13-23分）、中度（5-12分）、重度（＜5分）。

1.3 統計學分析 使用SPSS20.0軟件分析數據。對照組Hard-Weinberg遺傳平衡定律吻合度采用χ2檢驗。計量資料以()表示，行F檢驗，兩組間比較行t檢驗；計數資料以(%)表示，行χ2檢驗，檢驗水準為α＝0.05。

2 結果

2.1 各組AopE基因頻率分布 經χ2檢驗，對照組AopE基因型頻率符合Hard-Weinberg遺傳平衡定律，P值分別為0.180和0.460。VD組以及NVD組AopEε4等位基因頻率均高于對照組（P＜0.05），VD組和NVD組AopEε3等位基因頻率均低于對照組（P＜0.05）。見表1。

表1 各組AopE基因頻率分布[n(%)]

2.2 各組AopE、circRNA、LncRNA水平比較 AopE、circRNA、LncRNA比較，VD組＞NVD組＞對照組（P＜0.05）。見表2。

表2 各組AopE、circRNA、LncRNA水平比較()

表2 各組AopE、circRNA、LncRNA水平比較()

注：與對照組比，*P＜0.05；與NVD組比，#P＜0.05。

2.3 不同VD嚴重程度AopE、circRNA、LncRNA水平比較 AopE、circRNA、LncRNA比較，輕度認知障礙組＜中度認知障礙組＜重度認知障礙組（P＜0.05）。見表3。

表3 不同VD嚴重程度AopE、circRNA、LncRNA水平的比較()

表3 不同VD嚴重程度AopE、circRNA、LncRNA水平的比較()

注：與輕度障礙組比，*P＜0.05。

2.4 AopE、circRNA、LncRNA在VD中的診斷效能分析 AopE、circRNA、LncRNA聯合診斷VD的敏感度和特異度分別為70.00%和90.00%，AUC為0.855，其效能優于各指標單獨診斷效能（Z=4.736、4.024、3.963，P=0.000、0.000、0.013，均＜0.05）。見表4及圖1。

表4 AopE、circRNA、LncRNA診斷效能分析

圖1 AopE、circRNA和LncRNA在VD中診斷價值的ROC圖

3 討論

VD是僅次于阿爾茲海默病引起老年群體癡呆第二大病因[6]。隨著社會老齡化的推進以及腦血管疾患的高發，VD的發病人數也與日俱增[7]。據統計，我國60歲以上的人群中VD患病率約為2.44%，僅次于阿爾茲海默病相關性癡呆[8]。故而，現階段VD的早期診斷以及防治對于腦血管疾病的患者而言至關重要。截至目前，國內外仍舊缺乏診斷VD的早期敏感指標，據調查，VD患者中僅有1/3的群體能夠在早期接受及時的診斷及干預，大部分患者就診時均已處于VD晚期，給生活帶來了較大的困擾，亟需尋找敏感、有效、方便且經濟的診斷指標。

有學者指出，缺血性腦卒中的發生與AopE基因多態性相關，高血壓、糖尿病、高脂血癥、冠狀動脈粥樣硬化等作為缺血性腦卒中的危險因素，亦與AopE基因的多態性也存在一定的相關性[9-10]。在ε2、ε3、ε4這3種等位基因中，ε4親和力最高，ε2親和力最低，因此對于血脂代謝產生相反的影響[11]。本研究中，VD組以及NVD組AopEε4等位基因頻率均高于對照組（P＜0.05），VD組和NVD組AopEε3等位基因頻率均低于對照組（P＜0.05），提示AopE基因可能通過調控血脂參與缺血性腦卒中的發生與發展中[12]。LncRNA通常由RNA聚合酶Ⅱ轉錄而成，既往研究及學者均認為其是“垃圾”分子[13]。近些年隨著分子技術的不斷發展，LncRNA的作用及生物學功能逐漸被挖掘。相關研究指出，LncRNA可廣泛存在于人類血液、體液以及組織中，且血漿LncRNA在經過反復凍融后仍能夠保持穩定，且各類型的LncRNA通常在正常組織中為較低表達，但在阿爾茲海默癥患者海馬組織以及腦血管疾病患者腦組織中均呈高表達[14-16]。本研究中，LncRNA比較，VD組＞NVD組＞對照組（P＜0.05），提示VD組患者出現LncRNA高表達的情況，與上述學者的觀點較為吻合。circRNA含量豐富且具有較高的組織特異性，已成為研究熱點，在心臟病以及阿爾茲海默病等多種疾病中作用突出，同時也與腦血管疾病的病理過程有著密切的關系[17-18]。本研究依據MMSE評分對VD患者的認知障礙情況進行劃分，發現AopE、circRNA、LncRNA比較，輕度認知障礙組＜中度認知障礙組＜重度認知障礙組（P＜0.05），提示隨著認知障礙的加重，AopE、circRNA以及LncRNA的水平也隨之上升并參與VD患者認知障礙的進展中。為明確AopE、circRNA和LncRNA在VD疾患中的診斷價值，本研究繪制ROC曲線發現，AopE、circRNA、LncRNA聯合診斷VD的敏感度和特異度分別為70.00%和90.00%，AUC為0.855，其效能優于各指標單獨診斷效能（P＜0.05），提示對上述指標進行聯合檢測有助于臨床中VD的診斷，盡早發現患者有無認知障礙狀況的發生，保障患者生命安全[19-20]。

綜上所述，VD患者存在AopE、circRNA以及LncRNA表達異常升高的情況，上述指標聯合檢測有助于臨床判斷VD患者有無認知障礙情況的出現，便于后續治療的開展，進而促進患者的預后。但對于AopE、circRNA以及LncRNA在VD患者中的病機尚未明了，需要后續更加深入以及擴大樣本量的研究。