精子頂體酶活性與ART受精率的相關性研究

黃玲,楊帆,江利,杜丹（湖南省郴州市第一人民醫院,湖南 郴州 423000）

目前，全世界已婚夫妻中不育癥患者約占15%[1]。隨著不育癥的發病率逐年遞增，使得輔助生殖技術（assisted reproductive technology，ART）廣泛應用于臨床。由于不育癥的病因既有女性因素也有男性因素，既往學者對女性不育的病因已經做了大量的研究，目前男性因素也在慢慢探索中。精液常規檢測作為男性生育力評估的基本方法，由于受男性生理狀態、檢測儀器及檢測人員等條件的不同，使得其檢查結果可能存在較大的偏差，有時并不能反映男性生育力的真實狀態，在ART治療及受精方式的選擇上可能存在一定的局限性。精子頂體酶是一種胰蛋白酶[2-3]，主要存在于精子頂體中，能夠以酶原的形式生成并儲存在精子頂體部位，當機體頂體反應發生時，就會激活并釋放頂體酶原。頂體酶是非常重要的一種蛋白水解酶，能夠為受精卵的結合創造條件。其能夠溶解卵子表面的透明帶，讓精子順利進入卵細胞中，精子頂體酶活性是精子質量的重要評價指標之一。相關研究顯示，精子頂體酶活性與精液常規參數有一定相關性，可以作為評估精子質量的一個客觀定量指標[4]，但對于IVF結局的預測價值較低，對ART治療及受精方式選擇的指導意義不明，且其對ART受精結局的影響及機制尚不明確，還需進一步的研究去闡明。因此，本研究的目的在于探討精子頂體酶活性對男性生育力評估、ART治療方案的選擇及受精率的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2020年1月-2020年12月在我院就診的852例女子獲卵數≥3枚因原發不育來行ART治療的夫婦作為研究對象。納入標準：①男方年齡范圍22歲-49歲；②同居或婚后未避孕一年以上而未孕者，且為原發性不孕；③男性生殖器官及性功能正常；④半年內未服用對檢驗結果有影響的藥物；⑤女方獲卵子數≥3枚。排除標準：①男女雙方合并有心臟、肝臟、腎臟等嚴重的原發性疾病者；②生殖器官有腫瘤或者發育不良者；③有生殖道感染者；④服用嚴重阻礙生精功能或影響精子活力的抗腫瘤藥物者；⑤嚴重少精子癥者。所有研究對象均告知并簽署知情同意書，該研究獲得我院倫理委員會批準。

1.2 主要儀器設備及檢測試劑 精子頂體酶活性定量檢查試劑盒購自深圳華康生物醫學工程公司，CX33型普通光學顯微鏡購自日本Olympus公司。HR801型酶標儀購置于深圳華科瑞科有限公司，Eppenddorf AG 5424高速離心機購置于Eppenddorf公司。

1.3 精液樣本采集及常規檢測分析 納入對象禁欲3-7天，院內自慰取精，樣本采集完成后置于37℃溫箱內液化，參照《人類精液檢查與處理實驗室手冊》（第5版）對精液量、精子濃度、活力和精子形態進行分析[5]。同時留取7.5除以精液濃度乘1000μl新鮮精液量用作精子頂體酶活性檢測。

1.4 精子頂體酶活性檢測用改良Kennedy法按照試劑盒說明書檢測精子頂體酶活性。用酶標儀檢測精子頂體酶活性的OD值，用公式計算精子頂體酶活性：體酶活性（μIU/106精子）=（測定管OD值-空白管OD值）/（247.5×7.5）×106。

1.5 統計方法 采用SPSS25.0統計軟件對數據進行處理。定性資料分析采用卡方檢驗，用率（%）表示。定量資料結果符合正態分布的采用t檢驗，用均值±標準差（）表示。非正態分布的采用非參數檢驗（Mann-WhitneyU檢驗）分析，用秩和檢驗作組間對比。用Pearson相關性分析各參數與精子受精率的相關性。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 卵子受精率相關因素分析 對納入研究的對象基本信息及精液常規參數與卵子受精率展開相關性分析，發現其與男方年齡、女方年齡、精子頂體酶活性及卵子成熟度相關（P＜0.05），相關系數r分別是0.090、0.124、0.096及0.491。與禁欲天數、精液量、精子濃度、精子前向運動（PR）、精子非前向運動（NP）、正常形態率、精子DNA碎片率（DFI）及精子的抗精子抗體（MAR）不相關（P＞0.5），詳見表1。

表1 卵子受精率與研究對象基本信息及精液參數的相關性

2.2 不同精子頂體酶活性定量結果為參考值時受精率的對比分析 由于本研究中納入對象精子頂體酶活性定量結果為非正態分布，試劑盒提供的參考值為48.2μIU/106精子。因此對精子頂體酶活性定量結果按單位為μIU/106值分別是35.0、42.2、48.2、51.2、51.7、53.8，并按此參考值分組，低于該值者為異常組，高于該值者為正常組。精子頂體酶活性定量結果按單位為μIU/106值分別是35.0、42.2、48.2、51.2μIU/106時，正常組卵子受精率高于異常組，P值分別是0.018、0.029、0.041、0.048，差異有統計學意義。精子頂體酶活性定量結果按單位為μIU/106精子值分別是51.7、53.8μIU/106時，正常組與異常組間受精率沒有統計學差異（P＞0.5）。詳見表2。

表2 不同頂體酶活性參考值頂體酶正常與異常組間受精率的對比分析

2.3 女方年齡大于40歲時，精液基本信息與精子頂體酶活性的相關性 由于女性年齡40歲是女性生育重要的年齡節點。本研究中將納入對象女方年齡大于40歲的99對夫妻，按頂體酶活性51.2μIU/106分組，大于51.2μIU/106者為精子頂體酶活性正常組，小于等于者為異常組。對于兩組間精液的量、精子濃度、前向運行精子比率（PR）、非前向運動精子比率（NP）、不動精子比率（IM）、抗精子抗體比率（MAR法）、精子DNA碎片率（DFI）、精子畸形率、男女雙方年齡等相關指標在精子頂體酶活性正常組與異常組間受精率沒有統計學差異（P＞0.5）。詳見表3。

表3 女方年齡＞40歲頂體酶分組統計相關性

3 討論

近年來，隨著社會壓力及競爭力的不斷增加，就業壓力加大及自然環境的不斷惡化，不孕不育的發病率逐年上升。世界衛生組織就將不孕不育、腫瘤及心腦血管疾病共同列為21世紀三大疾病[6]。不孕不育帶給社會和家庭的負擔是難以想象的，不僅加重經濟負擔，還會給患者帶來很大的心理壓力。目前，不孕不育由單方因素或男女雙方因素造成。根據相關流行病學調查顯示，在不孕不育夫婦中，約有40%-50%為女方因素，25%-40%是男方因素，雙方因素占20%-30%，剩余10%為不明原因[7]。隨著男性不育的患者數量不斷增加，男性不育因素也受到了社會多方面的廣泛重視。不孕不育的治療除常規藥物和手術外，近些年來輔助生殖技術在臨床上的應用，從很大程度上緩解了不孕不育夫婦的痛苦。輔助生殖技術體外授精方式的選擇要結合精子濃度、精子形態和精子活力等多種因素[8]。對于不育癥患者使用精液常規分析選擇授精方式，常規IVF治療方案中仍有可能出現低受精或完全不受精的情況。據文獻報道，在常規IVF中，發生低受精（包括完全不受精）的比率為3%-5%[9-10]。對此，采取有效方式預防或避免受精失敗及提高受精率提升IVF的成功率是臨床的重點問題。

在輔助生殖技術的早期研究[11-12]中發現精子參數與受精結果有較強相關性，臨床妊娠結局不受精子常規參數的影響，卻與女性配偶的生育狀態和年齡的相關性更強。所以本研究排除影響女性懷孕的干擾因素后大大減少入組病例數，這樣能更好地做好質控控制和單因素的分析，將研究重點關注在精子參數、頂體酶與受精能力的相關性上。在此條件下，在本研究中，對納入研究的對象基本信息及精液常規參數與卵子受精率進行相關性分析，發現其與男方年齡、女方年齡、精子頂體酶活性及卵子成熟度相關。這說明頂體酶是影響受精率的相關因素。這與趙淑芹[13]的研究亦證明了精子頂體酶活性與IVF受精率呈正相關性的結論一致。Henkel[14]等人對114名行IVF治療的男性的精子頂體酶活性與IVF受精率的相關性進行了研究，發現精子的受精潛力與精子頂體酶活性相關，另外有一些學者也得出了同樣的結論[15]。由此可見，精子頂體酶活性在受精過程中起著非常重要的作用。

在本研究中，納入對象精子頂體酶活性定量結果為非正態分布，試劑盒提供的參考值為48.2μIU/106。不同實驗室由于儀器設備及檢驗人員的不同，其結果可能有所偏差。對此，對納入對象的精子頂體酶活性定量結果進行秩和檢驗，由于小于參考值的納入對象為101名，對其按組間間距分3組，其對應精子頂體酶活性定量結果按單位為μIU/106值分別是35.0、42.2、48.2。低于該值者為異常組，高于該值者為正常組。正常組卵子受精率高于異常組，P值分別是0.018、0.029、0.041，差異有統計學意義。同樣精子頂體酶活性為51.2μIU/106時，正常組受精率高于異常組（P=0.048）。精子頂體酶活性定量結果按單位為μIU/106值分別是51.7、53.8μIU/106時，正常組與異常組間受精率沒有統計學差異（P＞0.5）。提示精子頂體酶活性定量結果51.2μIU/106可能是本實驗室的參考值，這與王金保[16]等人的研究結果頂體酶正常組受精率高于異常組，差異無統計學意義。但對于頂體酶異常組進一步組間間距分組發現頂體酶小于25μIU/106受精率明顯均低于正常組，差異有統計學意義。這可能與各實驗室儀器設備及操作人員不同相關。同時，本研究數據樣本量不大，還需進一步深入研究。

對于女性年齡大于40歲的夫妻中，筆者發現在頂體酶正常組與異常組中，在男女雙方年齡、精液常規參數、精子DFI、精子形態率均無統計學差異的條件下，兩組間的受精率無統計學差異。這可能與女性年齡是影響生育力及妊娠結局的獨立危險因素相關[17]。這也說明當女性年齡大于40歲時，男方的基本精液參數對于女性受精率的影響參考意義不大。

因此，在輔助生殖助孕的過程中，需要考慮夫妻雙方的情況合理地選擇受精方式，在女性年齡小于40歲時，頂體酶是影響受精率指標之一；當頂體酶活性＜51.2μIU/106時，可以考慮選擇ICSI的受精方式來助孕。