BMSC-Exo通過Wnt/β-catenin途徑參與股骨頭壞死大鼠軟骨細胞增殖、遷移和凋亡的機制研究

龔東亮 付文芹（復旦大學附屬中山醫院青浦分院骨科，上海 201799）

股骨頭壞死（femoral head necrosis，FHN）的發生與軟骨喪失密切相關，Wnt/β-catenin是一類與胚胎骨骼形成、組織修復和關節穩態有關的經典通路，并參與激素誘導的FHN［1］。Wnt/β-catenin通路調節多個信號級聯反應，具有促進骨肉瘤細胞增殖、遷移和抑制凋亡的作用，Wnt/β-catenin通路可能通過促進軟骨的再生緩解FHN［2］。骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）具有組織修復能力，研究證實了由BMSCs分泌的外泌體（exosomes，Exo）具有治療FHN的作用，但其機制仍不清楚［3］。BMSCs具有強大的分泌功能，研究顯示其分泌的Exo可緩解軟骨退變損傷［4］。本文主要分析BMSCs-Exo通過Wnt/β-catenin途徑對FHN大鼠軟骨細胞的遷移、增殖和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1材料Sprague-Dawley（SD）大鼠由上海斯萊克實驗動物責任有限公司提供［許可證號：SCXK（滬）2012-003］（SPF級，雄性，8～10周齡，270～290 g）。氨基甲酸乙酯（上海清溪化學技術有限公司，中國）；DMEM培養基、胎牛血清（Gibco公司，美國）；FACSCantoⅡ流式細胞儀和染色試劑（BD公司，美國）；RNAspin Mini（GE Healthcare，美國）；Bestar qPCR RT和BestarTMqPCR試劑盒（DBI Bioscience公司，德國）；ECL顯色試劑盒（Thermo Fisher公司，美國）；抗體、一抗和山羊抗免疫球蛋白G（IgG）二抗（1∶1 000稀釋，#ab6721）（Abcam公司，美國）；硝酸纖維素膜（EMD Millipore，美國）；顯微鏡（Carl Zeiss公司，德國）；NanoSight NS300粒度儀（馬爾文公司，英國）。

1.2方法

1.2.1BMSCs-Exo的分離和培養根據參考文獻［5］，通過腹膜內注射氨基甲酸乙酯（20%生理鹽水，5 ml/kg）麻醉大鼠。采用滅菌的磷酸緩沖液從大鼠的脛骨和股骨中沖洗出骨髓，通過過濾器過濾并懸浮于DMEM培養基中，補充10%的胎牛血清、10 U/ml的青霉素和100 μg/ml的鏈霉素。隨后將細胞在37℃、含5%CO2的環境中培養24 h。當細胞達到90%匯合時，胰蛋白酶消化，然后重新鋪板在25 cm2培養瓶中為第0代。本研究使用了第3代BMSCs。……