氮磷添加對羊草-土壤-根際微生物化學計量特征的影響

鄭斯元，王英逵，劉鞠善，李 杰，王德利

(東北師范大學草地科學研究所，植被生態科學教育部重點實驗室，吉林 長春 130024)

生態化學計量學(Ecological stoichiometry)是目前生態學關注的重要理論之一，該理論認為，有機體所需要的影響生態系統的生產力、營養循環和食物網動態的多種元素(主要是C，N，P)之間處于多重平衡.這一理論也適用于研究生態系統內不同結構層次的養分循環[1].生態化學計量學主要基于動態平衡的原理，即當外界環境的變化在一定限度內時，有機體能保持自身的化學計量處于相對穩定之中，并與環境中的化學計量元素保持相對平衡狀態.C，N，P是維持和完成生物有機體生命活動的主要元素，同時也是影響生態系統生產力的重要元素[1].C，N，P 含量及化學計量特征可以用來研究植物各器官的元素分配，確定植物-土壤-微生物等不同生態系統組分之間的養分循環關系.

生態系統的地上和地下部分是緊密相連的，它們之間的互相作用可以極大影響生態系統的過程和性質[2].土壤 C，N，P 含量及化學計量關系可直接反映土壤肥力情況，也間接表明了植物的營養狀況[3].植物與土壤之間的養分遷移則是通過微生物以及它們所產生的有機物分解酶來介導的.研究發現，在半干旱草原，不同功能群植物與其根際土壤的化學計量之間存在顯著相關性，但與其根際微生物化學計量之間的相關性較弱[4]；桉樹(Eucalyptusrobusta)和兩種林下植物的N/P與土壤的N/P均密切相關[2]，且土壤 C/N/P的化學計量比顯著影響植被的C，N，P含量及生態化學計量變化[5]；在撂荒以及種植檸條(Caraganakorshinskii)和刺槐(Robiniapseudoacacia)的3種土地利用方式下，植物細根與微生物C/N/P化學計量比的變化方向一致(尤其N/P的變化)[6].這些研究結果表明，植物、土壤和微生物的C/N/P化學計量特征之間存在一定的相關性，且存在強弱區別.植物根際的生長情況可以直接影響土壤中微生物的生物量、群落結構以及土壤的養分特征[7].根際內的植物-微生物養分反饋也會通過養分的礦化和固持來影響土壤化學計量特征[8].根際微生態系統理論(Rhizosphere micro-ecosystem theory)將生態系統的概念導入到根際中，以植物-土壤-微生物作為研究對象，既可將其視作一個統一且特殊的整體來研究不同組分之間的關系，也可獨立研究其中每一組分的特征[9].因此，根際不僅是生態系統地上、地下組成部分之間進行養分和能量交換的重要界面，也是一個特殊的生態系統.

N和P是草地關鍵的限制性營養元素，大氣氮沉降和施肥等自然和人為形式的N輸入會改變草地的N和P循環過程，從而對草地中各生物與非生物組分的N和P含量及其化學計量特征產生影響.N添加可以通過增加土壤N的利用率來減輕N限制，從而刺激植物、微生物的生長發育，提高植物群落生物量和微生物活性，改變植物-土壤-微生物之間的養分分配關系[10].但是，直接添加無機N也會使植物和微生物對養分產生強烈競爭，從而導致劣勢競爭者的化學計量失衡并受到土壤中養分的限制[10].此外，N沉降還會影響植物體內P的吸收、轉化和儲存過程，從而將植物受到的N限制轉變為P限制[11].與N不同，植物無法從大氣中獲得P，但人類活動(如施P肥等)可對P循環產生一定的干擾[12].雖然迄今已有大量關于N和P添加對草地化學計量特征影響的研究，但關于根際微生態系統中各組分C，N，P含量的變化及限制機制的研究仍然較少.為此，本研究以松嫩草地的建群種與優勢種羊草(Leymuschinensis)作為研究對象，從生態化學計量的角度，探討了N和P添加條件下羊草根際微生態系統中關鍵養分元素(C，N，P)的變化、權衡與聯系，以更深入地闡釋植物和微生物的養分限制機制以及地上-地下生物互作的復雜性，并為根際微生態系統理論在化學計量方面的研究提供有效的參考.

1 研究方法

1.1 研究區概況

研究區位于吉林省長嶺縣境內的東北師范大學松嫩草地生態研究站(北緯44°45′、東經123°45′).該區域位于歐亞大陸草原帶東緣，氣候屬于典型的溫帶大陸性氣候，年平均氣溫4.9 ℃～6.7 ℃；年均降水量280～400 mm，其中約70%集中在植物生長季(6—8月)；年均蒸發量1 500～2 000 mm，遠高于降水量.區域主要土壤類型為鹽堿化草甸土(pH=7.5～10.0).

1.2 實驗材料與設計

本實驗采用的植物材料為羊草.羊草為歐亞大陸東部草原上的建群種和優勢種，也是優良牧草之一，具有抗干旱、抗寒冷、耐鹽堿的能力，具有重要的生產與生態利用價值[13].2018年6月，選取飽滿的羊草種子，用75%的酒精消毒后播種到育苗盤中萌發.待羊草幼苗長出，選取大小一致的幼苗(株高(10±0.5)cm)移栽至花盆中(盆內徑32 cm，高20.9 cm)，以供實驗之用.

本研究采用盆栽實驗，實驗設計為完全隨機設計.實驗共設置4種處理方式：對照(CK)，N添加(+N)，P添加(+P)以及N和P共同添加(N+P).根據松嫩草地生態研究站自2009年設置的長期N添加實驗平臺[14]，本實驗N添加量為10 g/(m2·a)，以硝酸銨(NH4NO3)的形式添加；P添加量為5 g/(m2·a)，以磷酸二氫鈣(Ca(H2PO4)2)的形式添加.每個處理有8個重復，共計32盆.在每盆中種植12株羊草幼苗，盆內裝土10 kg.待幼苗長勢穩定后，進行養分添加.養分添加分3次進行(1次/周)，每次添加總施用量的1/3.實驗用土為草甸土，土壤pH=7.68，電導率為268.80 μs/cm，總C含量為7.68 mg/g，總N含量為0.64 mg/g，總P含量為0.12 mg/g.將本實驗盆栽統一放置于野外溫室中，以避免自然降水對實驗的干擾.

1.3 樣品采集與分析測定

2018年8月末，對羊草進行破壞性取樣，取每個盆栽中羊草的地上葉片和地下根系部分.取羊草根系時，取搖動主干后仍附著在根部的土壤作為根際土壤，保存在4 ℃的冰箱內，用于土壤和根際微生物指標的測定.將羊草葉片、根系部分置于信封內放入烘箱，105 ℃殺青30 min后放于65 ℃烘箱內烘干(72 h)至恒重.烘干的羊草樣品使用球磨儀磨至粉末狀后，利用穩定同位素質譜儀(Isoprime 100)測定葉、根的總C、總N含量，利用全自動間斷分析儀(Smartchem 450型)測定總P含量.取部分根際土壤樣品自然風干，用0.15 mm細篩過濾后，利用總有機碳分析儀(Elementar Vario)、凱氏定氮儀(Kjeltec 8400)、全自動間斷分析儀分別測定土壤的總C含量、總N含量、總P含量.取新鮮根際土壤樣品，采用氯仿熏蒸法測定羊草根際微生物總生物量.利用總有機碳分析儀、凱式定氮儀和分光光度計(UV-2201)分別測定微生物生物量中C，N，P的含量.

1.4 數據處理

首先采用單因素方差分析(One-way ANOVA)檢驗+N、+P及N+P添加處理對羊草根、土壤及根際微生物C，N，P含量及化學計量比特征的影響，若方差不齊則采用非參數檢驗方法.然后采用Turkey’s多重比較分析4種處理下植物、土壤和根際微生物C，N，P含量及其化學計量學特征的差異.采用Person相關分析方法分析4種處理下羊草與土壤之間、土壤與根際微生物之間以及羊草與根際微生物之間的C，N，P含量及化學計量特征的內在聯系.使用CANOCO(Version 5.0)平臺對羊草根、葉、根際微生物與土壤因子，根、葉與根際微生物因子進行冗余分析(RDA)排序，并繪制二維排序圖.所有檢驗顯著性水平為P<0.05.統計分析利用SPSS 23.0軟件完成.

2 結果與分析

2.1 土壤有機碳含量、N含量、P含量及其生態化學計量比特征

N和P的添加對土壤養分及化學計量比的影響不同(見圖1).+N處理下土壤有機碳含量(SOC)顯著增加14.24%，而+P以及N+P處理對SOC無顯著影響.+N處理下土壤N含量顯著增加12.86%，而+P以及N+P處理對土壤N含量無顯著影響.+P以及N+P處理均顯著增加了土壤的P含量(分別增加100.35%和119.10%)，其中N+P處理下土壤P含量增加最多.+N、+P及N+P處理對土壤C/N均無顯著影響；+N、+P及N+P處理顯著降低了土壤的N/P(分別降低24.06%，52.76%和54.59%)，其中+P及N+P處理土壤N/P下降最多；+P及N+P處理顯著降低了土壤的C/P(分別降低53.54%和53.83%).

不同小寫字母表示不同處理下土壤C，N，P含量及C/N、N/P、C/P差異顯著(P<0.05)，下同

2.2 羊草根、葉的C，N，P含量及其生態化學計量比

羊草根、葉的C，N，P含量及化學計量比對N和P添加的響應存在差異(見圖2).+N、+P及N+P處理對根的C含量均無顯著影響，但在+N及N+P處理下，羊草葉的C含量顯著增加2.12%和3.48%.+N及N+P處理使根的N含量顯著增加81.61%和52.05%，而+P處理則使葉的N含量顯著降低30.11%.+P和N+P處理顯著增加了葉的P含量(分別增加63.03%和46.09%)，而+N處理則使葉的P含量顯著下降了45.15%.根的P含量僅在+P處理下增加66.06%.+N處理未顯著改變葉的C/N，但使根的C/N顯著降低47.20%.+N處理使葉、根的N/P均顯著增加(分別增加111.09%和106.35%).+N處理使葉的C/P顯著增加91.38%.在+P處理下，葉的C/N顯著增加42.99%，葉、根的N/P和C/P均顯著降低(葉分別降低57.01%和38.53%，根分別降低42.77%，33.80%).N+P處理對葉的C/N、N/P、C/P均無顯著影響，僅顯著降低了根的C/N和C/P(分別降低36.54%和31.45%).

圖2 N和P添加處理下羊草葉、根的C，N，P含量及其生態化學計量比特征

2.3 根際微生物C，N，P含量及其生態化學計量比

羊草根際微生物的C，N，P含量及化學計量比在4種處理下的變化均不相同(見圖3).由圖3可見，+N、+P及N+P處理均顯著降低了羊草根際微生物生物量中的C含量(分別降低36.65%，47.05%和28.84%).+N、+P及N+P處理羊草根際微生物的N含量也均顯著降低(分別降低21.03%，50.42%和29.57%).+N、+P處理下微生物生物量中的P含量無顯著變化，而在N+P處理下微生物的P含量顯著增高69.02%.+N、+P及N+P處理下微生物的C/N均無顯著變化.+N處理下微生物N/P無顯著變化，而C/P顯著降低30.93%.在+P處理下，微生物N/P和C/P均顯著降低61.43%和60.85%.在N+P處理下，N/P和C/P也均顯著降低55.54%和55.70%.

圖3 N和P添加處理下根際微生物的C，N，P含量及其生態化學計量比特征

2.4 羊草、土壤及根際微生物養分和化學計量關系

由相關分析結果(見表1)可知，羊草葉、根、土壤和根際微生物的C，N，P含量及化學計量比之間存在一定的相關性(P<0.05).

表1 N和P添加處理下羊草(葉、根)-土壤-根際微生物生物量C，N，P含量及化學計量比的相關關系

續表1

在相關性分析的基礎上，以羊草葉、根、根際微生物的C，N，P含量及生態化學計量比為響應變量，以土壤的SOC、N含量、P含量及生態化學計量比為解釋變量，進行冗余分析(RDA).結果表明，SOC、N含量、P含量、C/N、N/P、C/P共6個變量可解釋羊草葉、根、根際微生物C，N，P含量及生態化學計量比變異的59.47%，54.29%，47.26%.其中，土壤N含量和N/P對羊草葉養分以及化學計量比具有顯著影響，且均達到極顯著水平(P<0.01)，土壤N含量的作用大于N/P(見圖4A、表2).而土壤的N/P和SOC對羊草根養分以及化學計量比具有顯著影響，且均達到極顯著水平(P<0.01)(見圖4B、表2)，土壤N/P的作用大于SOC.土壤C/P和N/P對羊草根際微生物養分及化學計量比具有顯著影響，其中土壤C/P達到極顯著水平(P<0.01)(見圖4C、表2).

A.土壤與羊草葉化學計量特征冗余分析；B.土壤與羊草根化學計量特征冗余分析；C.土壤與根際微生物化學計量特征冗余分析；D.根際微生物與羊草葉化學計量特征冗余分析；E.根際微生物與羊草根化學計量特征冗余分析

以羊草葉、根的C，N，P含量及生態化學計量比為響應變量，以羊草根際微生物的C，N，P含量及生態化學計量比為解釋變量，對4種處理下葉、根的C，N，P含量及生態化學計量比進行冗余分析(RDA).結果表明，微生物生物量中的C，N，P含量及C/N、N/P、C/P共6個微生物因子解釋了葉、根的C，N，P含量及生態化學計量比變異的52.65%，50.22%.其中，微生物的C/N和P含量對羊草葉養分及化學計量比具有顯著影響，微生物C/N達到極顯著水平(P<0.01)(見圖4D、表2)；微生物的N/P對羊草根養分以及化學計量比具有顯著影響，且達到極顯著水平(P<0.01)(見圖4E、表2).

表2 N和P添加處理下土壤、根際微生物對羊草根、葉C，N，P含量及化學計量比的解釋量與顯著性檢驗

3 討論與分析

3.1 N和P添加處理對土壤SOC、N含量、P含量及其化學計量比的影響

N和P添加處理下，土壤SOC、N含量、P含量均有不同程度的增加，其化學計量比發生了不同程度的變化.+N處理顯著增加了土壤SOC和N含量，這是由于短期的N添加可抑制土壤CO2的外流，降低了土壤總呼吸(自養和異養)速率，減少了土壤微生物的生物量和活性[15]，顯著增加了土壤SOC；N添加還可促進硝化速率，使土壤中的無機N含量增加[16]，累積更多的養分.+P及N+P處理均會增加土壤P含量，這是由于在土壤中P比N更難溶且不易因淋溶等原因消失，所以更容易在土壤中積累[17].土壤C/N和C/P通常用來表示土壤的礦化能力以及土壤N和P的有效性，本研究中土壤C/P在+P及N+P處理下均顯著降低，表明P添加可增加土壤P的可用性，加快有機質分解速率，從而改善土壤的P限制.

3.2 N和P添加處理對羊草葉、根C，N，P含量及其化學計量比的作用

植物可以通過對不同元素的吸收分配進行權衡，從而維持自身C，N，P養分的協調與平衡，同時植物體不同器官的養分含量及化學計量比也能反映植物體的營養吸收和代謝情況.+N及N+P處理下，羊草葉C含量顯著增加，因為葉片是植物主要的光合器官，N添加可促進葉片的光合作用速率，同化更多的CO2[18].+N及N+P處理顯著增加了根的N含量，由于N的添加增加了植物根部對硝酸鹽的利用率，因此更多的N可用于根吸收和細根組織的儲備[19].通常將葉N/P作為植物營養限制的標準，因為在養分受限的環境中植物會傾向于分配給葉片更多的養分以滿足光合作用所需[20].Koerselman的研究[21]就將葉片N/P作為植物養分的限制標準：N/P<14表明植物受N限制，N/P>16表明植物受P限制，14

3.3 N和P添加處理對羊草根際微生物C，N，P含量及其化學計量比的影響

N和P的添加對羊草根際微生物生物量C，N，P含量及其化學計量比影響各有不同.在草地生態系統中，N是主要的限制性養分，且植物和微生物之間對N的競爭非常激烈[23].與植物相比，微生物的表面積與體積比更大，而且具有生長代謝速率快和N吸收速率高的特點，因此被認為是土壤中N競爭的優勢者[24].但本研究發現，在+N、+P及N+P處理下，羊草根際微生物的C和N含量均顯著降低，這可能是由于短期內的大量N和P添加使土壤中的C不足以維持微生物快速的初始生長速率，導致其再次受到C而非N和P的限制，造成根際微生物的大量死亡，從而降低了與植物競爭養分的能力，使植物成為養分競爭的優勢者.在N+P添加處理下微生物生物量中P含量顯著增加，這可能是由于N和P的共同添加促進了根際微生物對于磷酸酶的釋放[11]，從而有助于微生物對土壤中P的分解和吸收.微生物生物量C/N/P的化學計量是分解者群落養分需求的基礎，一般情況下土壤C/N/P化學計量的變化不會顯著影響土壤微生物生物量的C/N/P，微生物C/N/P化學計量處于相對平衡狀態(w(C)/w(N)/w(P)=60∶7∶1)[25].但在特定情況下，N和P的添加也可通過資源和微生物生物量之間的化學計量失衡導致特定養分對微生物活性的限制，并攝取土壤中的有機質調節自身的化學計量比[26].本研究發現，僅在+N處理下，微生物生物量C/N/P化學計量比值顯著下降，表明在松嫩草地，N的添加更易導致羊草根際微生物化學計量的失衡.

3.4 N和P添加處理下羊草-土壤-根際微生物C/N/P化學計量關系

本文的研究發現，在添加養分的情況下，羊草、土壤和根際微生物的化學計量之間均存在一定的相關性，表明養分的添加會影響根際微生態系統中的養分循環[1].Garnier[27]研究發現，植物中某元素濃度如果與土壤中該元素的濃度呈正相關，則植物受土壤中該元素的限制.本實驗中，羊草根N含量與土壤N含量、葉P含量與土壤P含量均呈顯著正相關，表明羊草受土壤中N和P的共同限制.土壤N含量和N/P對羊草葉C/N/P化學計量均有極顯著的影響.土壤N/P是土壤養分狀況的重要指標，進一步表明該研究區羊草生長受到土壤中N和P的共同限制，且受N的限制更強.土壤的N/P和SOC對羊草根的C/N/P也有顯著影響.土壤SOC是土壤肥力狀況的表示指標[28]，羊草在與根際微生物的養分競爭中，羊草根占據了優勢地位，因此土壤SOC含量對羊草根的C/N/P化學計量的影響更大.本研究與Sistla等[29]的研究結果一致，即土壤與微生物生物量化學計量之間具有一定相關性，在添加營養的條件下微生物可通過分解攝取土壤中的有機質來調節自身的化學計量.土壤C/P和N/P對微生物生物量化學計量均有顯著影響，盡管養分添加下土壤C，N，P含量均有不同的變化，但P含量的增加比率顯著高于C和N的增加比率，從而導致土壤C/P和N/P的顯著變化.與細菌相比，真菌對土壤P含量的變化更為敏感，土壤P含量增加可能改變了微生物的群落結構(如真菌/細菌的比率增加)[30]，從而導致真菌占據了競爭優勢地位，受到土壤C/P和N/P的影響更多.羊草葉、根的化學計量均與根際微生物的化學計量有一定的相關性，這可能是因為微生物可以產生富含C，N，P和其他營養物質的酶，并根據其相對于資源供應的基本需求來保留或釋放養分，從而控制、調節植物可利用的養分[31].微生物生物量的C/N和P含量對葉的影響更大，微生物生物量的N/P對根的影響更大，其中微生物的C/N對葉化學計量的影響主要來源于微生物生物量中的N含量而非C含量的改變(見表1)，所以羊草根、葉的C/N/P化學計量除了受土壤中N和P含量的限制，也會受根際微生物生物量中N和P含量變化的限制[32].結合RDA解釋率和相關性分析的結果，發現在根際微生態系統中土壤與羊草之間的相關性比土壤與微生物以及羊草與微生物之間的相關性更強.這可能是由于養分添加破壞了微生物的C/N/P化學計量的平衡，導致微生物受到了C限制，從而在與植物的養分競爭中處于劣勢地位，進而與羊草和土壤C/N/P化學計量關系趨于解耦.但與羊草根相比，土壤、根際微生物均與羊草葉化學計量之間的相關性更強，這可能與植物自身的營養分配策略有關，植物葉片進行光合作用需要更多的養分，所以對土壤和微生物中的養分，尤其是N和P含量的依賴性更強.

4 結論

(1) 在+N、+P及N+P處理下，羊草(葉、根)、土壤以及根際微生物的C，N，P含量及比值均產生了不同程度的變化.N的添加增加了土壤SOC和N的含量，P的添加和N與P共同添加增加了土壤P含量.N的添加增加了葉中的C和根中的N含量，降低了葉的P含量；P的添加降低葉N的含量，增加了葉、根的P含量；N和P的共同添加增加了葉中C和P的含量以及根中N的含量.N和P的分別添加及共同添加降低了根際微生物的C和N含量，而N和P的共同添加增加了微生物的P含量.

(2) 羊草生長受到了N和P的共同限制，其中N的限制更強.添加N雖能緩解N限制產生的影響，但會將植物生長所受的限制轉變為P限制；而P的添加則會加劇草地受N限制的程度，破壞植物C/N/P化學計量的平衡.

(3) N和P的添加可導致根際微生物的C限制，減少了根際微生物的生物量，從而使根際微生物在與植物的養分競爭中處于劣勢地位.

(4) N和P添加條件下的根際微生態系統中，與植物根相比，土壤和根際微生物均與植物葉的化學計量關系更緊密.總體而言，植物和土壤均與微生物之間的化學計量關系趨向于解耦合，由此導致植物-土壤-微生物系統中各組分的C，N，P化學計量失衡，降低了根際微生態系統的穩定性.

本研究也為根際微生態系統理論在化學計量學方面的應用提供了有效參考.