木姜葉柯種質(zhì)資源評(píng)價(jià)及其黃酮物質(zhì)生物合成調(diào)控研究進(jìn)展

邱小燕, 肖深根, 李自強(qiáng), 王依清, 陳陽(yáng)峰, 向助文

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院, 湖南長(zhǎng)沙 410128；2.湖南瑤茶工程技術(shù)研究中心, 湖南溆浦 419300；3.湖南翱康生物科技有限公司, 湖南溆浦 419300；4.懷化學(xué)院生物與食品工程學(xué)院, 湖南懷化 418000）

木姜葉柯（Lithocarpus litseifolius（Hance）Chun）俗稱“甜茶”, 長(zhǎng)江以南各省區(qū)均有分布, 其中湖南、江西等省資源尤為豐富[1]。《全國(guó)中草藥匯編》記載“木姜葉柯可用于防治癰疽惡瘡、皮膚瘙癢和溫?zé)崃〖驳劝Y狀”[2]。民間以木姜葉柯嫩葉作為甜茶飲用已有悠久的歷史, 其味甘甜持久、香氣濃郁。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明, 木姜葉柯中的主要有效成分為黃酮物質(zhì), 具有降三高、抗氧化等作用[3-6]。木姜葉柯既是我國(guó)民族珍貴藥材, 又被批準(zhǔn)為色素添加劑和新食品原料資源, 兼具藥、茶、糖的功能, 極具開(kāi)發(fā)價(jià)值。近年來(lái), 隨著木姜葉柯產(chǎn)業(yè)的發(fā)展, 由于野生木姜葉柯是高大的喬木, 很多地方都以砍伐野生木姜葉柯來(lái)獲取嫩葉。因此, 木姜葉柯野生分布面積逐年降低, 造成木姜葉柯種群和個(gè)體數(shù)減少, 其種內(nèi)遺傳多樣性丟失, 最終不利于植物的生存；同時(shí), 黃酮物質(zhì)又是木姜葉柯葉片提取物的主要活性成分, 因此建立木姜葉柯種質(zhì)資源圃, 篩選優(yōu)異種質(zhì), 探明木姜葉柯黃酮物質(zhì)的生物合成調(diào)控機(jī)制極為重要。綜述了木姜葉柯種質(zhì)資源及其黃酮物質(zhì)生物合成調(diào)控的研究進(jìn)展, 展望了木姜葉柯未來(lái)研究的方向。

1 木姜葉柯種質(zhì)資源研究現(xiàn)狀

1.1 2種“甜茶”的基源比較

木姜葉柯和廣西甜茶都俗稱“甜茶”, 民間飲用歷史悠久, 都是高甜、低熱、無(wú)毒的天然甜味劑, 具有解渴生津、防治糖尿病和降血壓等功效, 容易混淆, 雖然都俗稱“甜茶”, 但是它們的區(qū)別非常大。木姜葉柯（Lithocarpus litseifolius（Hance）Chun）是殼斗科柯屬的常綠喬木, 葉片為革制、互生, 幼芽紫褐色、披短絨毛, 成熟葉皮為灰褐色、葉片呈卵狀、基部楔形、先端漸尖, 主要含黃酮類、三萜類及其他化合物, 其總黃酮含量高達(dá)10%, 主要集中在葉部, 其甜味成分主要是二氫查耳酮類[7-8]。廣西甜茶（Rubus Suavissimuss S.Lee）是薔薇科懸鉤子屬多年生落葉灌木, 葉片和枝條稍軟, 幼苗紫紅色, 成熟葉為綠色, 先端彎垂[9], 主要含甜茶素、黃酮、茶多酚等活性成分, 其主要甜味成分是甜茶素, 含量達(dá)1.5%, 嫩葉中總黃酮為0.35%, 老葉中總黃酮為0.022%, 其黃酮物質(zhì)主要是槲皮素和山奈酚[10]。

1.2 不同采收期木姜葉柯黃酮物質(zhì)含量變化規(guī)律

木姜葉柯在不同采收期的黃酮物質(zhì)含量差異較大。劉燦明等人[11]研究了湖南漣源野生木姜葉柯總黃酮含量在3月份為11.46%, 4月份為14.60%, 5月份為9.60%, 4月份的總黃酮含量最高。廖曉峰等人[12]測(cè)定了江西武夷山的木姜葉柯總黃酮含量在4月份高達(dá)22.2%。李勝華等人[13]對(duì)湖南芷江的木姜葉柯嫩葉中的總黃酮研究表明, 從4—12月呈先上升后下降的趨勢(shì), 夏末初秋即（6-9）月的總黃酮含量最高達(dá)9.87%, 10月份開(kāi)始降低, 12月份最低。徐蘭芳[14]研究了江西吉安木姜葉柯老葉中總黃酮含量的變化規(guī)律, 在8和9月份達(dá)到峰值25.51%和23.45%, 在2月和4月分別有2個(gè)小峰值, 為16.08%和14.82%。游曉瑩[15]研究木姜葉柯嫩葉中的根皮苷和三葉苷在不同采收期的變化規(guī)律, 根皮苷含量在7月份達(dá)到最高峰（5.7%）, 而后下降至9月達(dá)到最低谷（2.27%）, 然后又在11月達(dá)到一個(gè)次高峰（5.6%）, 然后呈下降的趨勢(shì), 三葉苷則在7月含量最高達(dá)4.5%, 5, 6, 7月均檢測(cè)不到三葉苷, 其他月份的含量均在1%以下。徐蘭芳[14]對(duì)江西吉安的木姜葉柯老葉中的根皮苷和三葉苷在不同采收期的變化規(guī)律, 根皮苷在2, 4, 7, 10月出現(xiàn)峰值, 分別為7.33%, 8.07%, 7.52%和8.17%。三葉苷則在3, 6, 10月達(dá)到峰值分別為0.82%, 0.98%和1.19%。綜上所述, 若以總黃酮含量作為采收質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo), 嫩葉宜在4月和6—9月采收, 老葉宜在2月和6—10月采收；若以根皮苷含量作為采收質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo), 嫩葉宜在7月采收, 老葉宜在2, 4, 7, 10月采收；若以三葉苷含量作為采收質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo), 嫩葉宜在7月采收, 老葉宜在3, 6, 10月采收。前期研究表明, 不同采收期黃酮物質(zhì)含量差異較大；然而, 木姜葉柯不同采收期黃酮物質(zhì)合成累積差異的機(jī)制尚未探明, 需要進(jìn)一步研究。

1.3 不同種源木姜葉柯黃酮物質(zhì)含量比較

不同種源對(duì)木姜葉柯黃酮物質(zhì)含量的影響也較大。徐蘭芳[14]在5月份比較廣東廣州和廣東惠州2個(gè)不同種源的根皮苷和三葉苷含量, 結(jié)果表明惠州的根皮苷含量較低, 三葉苷則高達(dá)6.06%, 廣州的三葉苷含量較低, 根皮苷含量則高達(dá)4.27%。何平等人[16]對(duì)江西分宜、四川米易、湖南溆浦、重慶北碚和廣西田林5個(gè)種源木姜葉柯葉片的黃酮物質(zhì)進(jìn)行了比較, 存在極顯著差異, 其中總黃酮含量最高的資源為江西分宜（8.16%）, 根皮苷含量最高的資源為重慶北碚（6.44%）, 三葉苷含量最高的資源為四川米易（2.99%）。王坤等人[17]對(duì)6個(gè)省份的30個(gè)木姜葉柯種源進(jìn)行了老葉根皮苷和嫩葉三葉苷含量的測(cè)定, 其中根皮苷含量最高的資源為廣西, 老葉中高達(dá)16.29%, 三葉苷含量最高的資源為重慶, 嫩葉中高達(dá)31.41%。上述結(jié)果表明, 不同種源的木姜葉柯黃酮物質(zhì)含量具有極大的差異, 但是上述研究中的材料均取自種源地, 并沒(méi)有將資源移至同一個(gè)資源圃, 黃酮物質(zhì)的含量受到環(huán)境因素的影響較大。因此, 建立木姜葉柯種質(zhì)資源圃, 消除環(huán)境因素的影響, 在當(dāng)?shù)氐纳鷳B(tài)環(huán)境下, 根據(jù)不同需求篩選優(yōu)異種質(zhì)顯得尤為重要。

1.4 不同種源木姜葉柯遺傳多樣性分析

木姜葉柯遺傳基因的種源變異是影響木姜葉柯黃酮物質(zhì)含量的關(guān)鍵因素。Cheng J等人[18]利用11個(gè)SSR分子標(biāo)記研究了浙江、重慶、廣西、江西、湖南和福建6個(gè)省份共11個(gè)種群的遺傳變異和種群結(jié)構(gòu), 結(jié)果表明大部分變異發(fā)生在種群內(nèi), 木姜葉柯種群間沒(méi)有發(fā)生較大的遺傳變異, 遺傳距離可能與地形相關(guān), 與地理距離之間沒(méi)有相關(guān)性。綜上所述, 前期的研究還缺乏云貴高原、陜西和福建等典型高原地形、高緯度、低海拔山地等具有代表性的種質(zhì)資源, 且沒(méi)有進(jìn)行木姜葉柯的有效成分與遺傳多樣性的關(guān)聯(lián)分析, 同時(shí)也沒(méi)有研究木姜葉柯的系統(tǒng)進(jìn)化, 這些在后續(xù)的科研工作中都值得研究。

2 木姜葉柯黃酮物質(zhì)生物合成調(diào)控研究進(jìn)展

2.1 木姜葉柯植物中黃酮物質(zhì)生物合成途徑及關(guān)鍵酶

基因是影響木姜葉柯生理機(jī)制的內(nèi)在遺傳因素, 黃酮類化合物的生物合成是一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò), 涉及到多個(gè)關(guān)鍵基因和關(guān)鍵酶。有研究表明, 植物體內(nèi)黃酮類化合物的生物合成基本途徑（見(jiàn)圖1[19]）, 首先由乙酰CoA合成丙二酰CoA, 再由莽草酸途徑獲得對(duì)-香豆酰CoA, 對(duì)-二氫香豆酰CoA由對(duì)-香豆酰CoA在還原酶催化作用下得到, 根皮素由對(duì)-二氫香豆酰CoA與丙二酰CoA在查爾酮合成酶的催化作用下得到, 根皮苷由根皮素在糖基轉(zhuǎn)移酶的催化作用得到[20]。宋菊等人[21]對(duì)木姜葉柯進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序并挖掘到黃酮合成相關(guān)基因28條, 除了查爾酮異構(gòu)酶和合成酶等關(guān)鍵酶基因, 還有苯丙氧酸解氨酶、乙酰輔酶A羧化酶、花青素合成酶等重要酶基因。尹峰等人[22]克隆了木姜葉柯黃酮3-羥化酶基因, qRT-PCR驗(yàn)證表明, 木姜葉柯黃酮3-羧化酶基因在根、莖、葉柄和葉片中的表達(dá)量差異顯著, 其中葉片表達(dá)量最高, 是最低表達(dá)根部的6.7573倍。林麗梅等人[23]克隆了木姜葉柯的查爾酮異構(gòu)酶基因, 該基因在木姜葉柯的葉片、葉柄、莖和根中的表達(dá)量差異顯著, 其中葉片相對(duì)表達(dá)量最高, 是最低表達(dá)部根的9.75倍。邢朝斌等人[24]克隆了木姜葉柯4-香豆酸輔酶A-連接酶基因木姜葉柯4-香豆酸輔酶A-連接酶基因在除根以外的各個(gè)器官中均表達(dá), 且根皮苷含量與該酶的表達(dá)量呈顯著正相關(guān), 在葉片中表達(dá)最高。朱金麗等人[25]克隆了木姜葉柯的無(wú)色花青素還原酶基因, 該基因的表達(dá)量與木姜葉柯根皮苷含量呈顯著正相關(guān), 無(wú)色花青素還原酶基因的表達(dá)可以促進(jìn)根皮苷的積累。綜上, 木姜葉柯黃酮類化合物的生物合成受到多種基因的共同調(diào)控。因此, 更加深入地研究木姜葉柯黃酮生物合成基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò), 構(gòu)建出完整的木姜葉柯黃酮代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)對(duì)提高木姜葉柯品質(zhì)及實(shí)現(xiàn)木姜葉柯黃酮的大量合成具有重要意義。

植物黃酮物質(zhì)生物合成基本途徑[18]見(jiàn)圖1。

圖1 植物黃酮物質(zhì)生物合成基本途徑

2.2 光照對(duì)木姜葉柯黃酮物質(zhì)生物合成調(diào)控的影響

黃酮物質(zhì)是木姜葉柯是適應(yīng)環(huán)境因子的產(chǎn)物, 在一定的環(huán)境脅迫下被誘導(dǎo)表達(dá)黃酮合成的相關(guān)酶基因, 關(guān)鍵酶催化黃酮物質(zhì)的合成[26]。光照會(huì)影響光合作用和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo), 也會(huì)影響黃酮物質(zhì)的合成[27]。伍賢進(jìn)[28]研究表明, 遮光40%的葉片中黃酮含量最高, 遮光80%的葉片中黃酮含量最低, 說(shuō)明適當(dāng)?shù)恼诠庥欣谀窘~柯葉中總黃酮的積累, 但遮光太多, 總黃酮的積累又受到一定的抑制。隨著遮光時(shí)間的持續(xù), 葉片中黃酮的含量由逐漸升高而轉(zhuǎn)變?yōu)橹鸩较陆? 在遮光60 d時(shí)各處理中葉中總黃酮的含量均達(dá)到最高。光質(zhì)對(duì)植物的各項(xiàng)生命活動(dòng)至關(guān)重要, 不同光質(zhì)可觸發(fā)植物體內(nèi)不同的光受體來(lái)感知, 以此來(lái)調(diào)控黃酮物質(zhì)的合成與積累。張妍彤[29]研究表明, 在紅光和藍(lán)光培養(yǎng)條件下, 木姜葉柯根皮苷含量均降低, 給與綠光刺激可促進(jìn)根皮苷的積累, 在低強(qiáng)度（1000 lx）處理時(shí), 根皮苷含量增加, 在高強(qiáng)度（2000 lx和3000 lx）處理時(shí)降低, 日光照8 h和11 h培養(yǎng)時(shí)根皮苷含量降低, 而日光照14 h培養(yǎng)時(shí)根皮苷含量增加, 可以提高3.49%, 表明適當(dāng)延長(zhǎng)綠光光照時(shí)間有提高根皮苷含量的可能。因此, 可以考慮采用綠光對(duì)木姜葉柯進(jìn)行低光強(qiáng)長(zhǎng)時(shí)間的微脅迫處理, 來(lái)誘導(dǎo)黃酮物質(zhì)的積累。一般短時(shí)間內(nèi)微脅迫處理難以達(dá)到顯著效果, 是否可以通過(guò)采用短期的強(qiáng)綠光脅迫處理來(lái)模擬放大前期微脅迫, 值得研究。

3 結(jié)語(yǔ)

木姜葉柯作為新資源食品原料, 有著廣闊的市場(chǎng)前景。在木姜葉柯種質(zhì)資源及黃酮物質(zhì)生物合成方面仍然需要深入研究, 主要有：①木姜葉柯黃酮物質(zhì)種源遺傳變異研究需要更加全面；②木姜葉柯黃酮物質(zhì)合成關(guān)鍵酶基因需要進(jìn)一步挖掘；③栽培措施對(duì)木姜葉柯黃酮物質(zhì)合成的影響需進(jìn)一步研究。總之, 需要多角度對(duì)木姜葉柯進(jìn)行綜合和可持續(xù)發(fā)展的研究, 推動(dòng)木姜葉柯產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。