魚皮膠原肽的制備及其品質(zhì)分析

王 霞, 畢桂燦, 賴園園

（1.廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院生物技術(shù)學(xué)院, 廣東 廣州 510000；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物質(zhì)工程研究院, 廣東廣州 510000；3.安徽國(guó)肽生物科技有限公司, 安徽 宣城 242000）

膠原蛋白是由3條肽鏈組成的螺旋纖維狀蛋白質(zhì)[1], 其空間結(jié)構(gòu)復(fù)雜, 分子量約為300 kD, 很難被機(jī)體直接吸收[2]。通過水解將膠原蛋白分解為膠原肽, 而相對(duì)分子量的大小是影響膠原肽吸收的重要因素。研究表明, 分子量為5 kD和3 kD的膠原肽具有良好的抗氧化、抗衰老和降血壓等生理活性[3]。膠原蛋白的氨基酸排列具有周期性特點(diǎn), 以三肽結(jié)構(gòu)Gly-X-Y為單位重復(fù)排列[4]。其中, 羥脯氨酸是膠原蛋白的特征氨基酸, 功能是維持膠原三股螺旋的穩(wěn)定性[5]。隨著對(duì)膠原肽品質(zhì)要求的提高, 其外觀顏色、氣味、水分含量、污染物含量、分子量的分布、羥脯氨酸含量等成為評(píng)價(jià)膠原肽品質(zhì)的重要項(xiàng)目。以羅非魚皮為原料, 通過酶解、微濾和超濾等工藝流程制備膠原肽, 以GB 31645—2018《膠原蛋白肽》為依據(jù), 對(duì)膠原肽進(jìn)行理化指標(biāo)評(píng)價(jià), 并對(duì)其相對(duì)分子質(zhì)量分布和羥脯氨酸含量進(jìn)行測(cè)定, 為酶解魚皮制備膠原肽的工藝提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SCAU膠原蛋白酶和魚皮, 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物質(zhì)工程研究所提供；NaOH（分析純）, 無(wú)錫晶科化工提供；HCl（分析純）, 永飛化學(xué)試劑提供；活性炭（食品級(jí)）, 湖北興恒業(yè)提供；羥脯氨酸含量檢測(cè)試劑盒, 北京索萊寶提供。

1.2 儀器與設(shè)備

BKQ-B75L型自動(dòng)蒸汽滅菌鍋, 博科高壓產(chǎn)品；FA1204型電子天平, 上海邦億產(chǎn)品；1810D型自動(dòng)雙重純水蒸餾器, 上海華巖產(chǎn)品；HH-4型恒溫水浴鍋, 江蘇科宏產(chǎn)品；Millipore Pellicon XL超濾膜包5 kDa, 德國(guó)密理博產(chǎn)品；ALPHA 1-2LD PLUS型真空冷凍干燥機(jī), 德國(guó)Marin Christ產(chǎn)品；MALDI-TOF型基質(zhì)輔助激光解析飛行時(shí)間質(zhì)譜, 德國(guó)Bruker Daltonics產(chǎn)品；戴安ICS-900型離子色譜儀, 美國(guó)產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 魚皮膠原肽的提取

魚皮洗凈, 刮去魚皮表面魚鱗和脂肪, 剪成小塊, 稱取10 g魚皮, 于121℃下高壓滅菌15 min, 按料液比1∶4（g∶mL）加入無(wú)菌水, 調(diào)節(jié)pH值, 加入SCAU膠原蛋白酶液, 水浴鍋中水解數(shù)小時(shí)后, 加入0.3 g活性炭粉于沸水浴中保溫5 min終止酶解, 冷卻至室溫, 抽濾得酶解液, 將酶解液冷凍干燥后得膠原肽粉, 計(jì)算膠原肽的提取率, 計(jì)算公式如下：

1.3.2 提取條件的優(yōu)化

反應(yīng)條件根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行調(diào)整, 選擇加酶量、酶解時(shí)間、酶解溫度、pH值為因素, 通過四因素三水平L9（34）正交試驗(yàn)確定最佳酶解條件。

正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

1.3.3 膠原肽的分離

在最優(yōu)條件下酶解魚皮, 酶解液經(jīng)過φ0.22μm微孔濾膜過濾和截流分子量為5000 Da的超濾膜過濾。濾液經(jīng)冷凍干燥后得膠原肽粉, 冷凍干燥的溫度為-50℃, 壓強(qiáng)為0.37 mbar, 時(shí)間為48 h。

1.3.4 膠原肽理化指標(biāo)和污染物限量的測(cè)定

膠原肽粉總氮含量的測(cè)定參照GB 5009.5—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》, 灰分含量的測(cè)定參照GB 5009.4—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中灰分的測(cè)定》, 水分含量的測(cè)定參照GB 5009.3—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中水分的測(cè)定》。鉛、鎘、總砷、鉻、總汞含量的由華南理工大學(xué)測(cè)試中心經(jīng)戴安ICS-900型離子色譜儀檢測(cè)。

1.3.5 膠原肽相對(duì)分子量分布

膠原肽相對(duì)分子量分布由中山大學(xué)測(cè)試中心經(jīng)基質(zhì)輔助激光解析飛行時(shí)間質(zhì)譜完成, 采集范圍為＜10000 Da。

1.3.6 膠原肽羥脯氨酸含量測(cè)定

參考羥脯氨酸含量檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行調(diào)整。稱取10 mg膠原肽粉, 加入6 mol/L鹽酸溶液5 mL溶解, 于110℃下水解6 h, 用濃度10 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0, 蒸餾水定容至16 mL, 取上清液為樣品液, 測(cè)定時(shí)稀釋10倍使用。

將試劑盒中的羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品（0.5 mg/mL）稀釋成質(zhì)量濃度為15.000, 7.500, 3.750, 1.875, 0.938, 0.469, 0.234, 0.117μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。取各質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液、樣品液和蒸餾水（空白）各200μL, 加入試劑盒中試劑一200μL, 混勻, 室溫靜置20 min。再分別加入試劑二200μL、蒸餾水400μL, 混勻, 于60℃水浴20 min, 室溫靜置15 min。以空白管調(diào)零, 于波長(zhǎng)560 nm處測(cè)定各管吸光度, 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算樣品中羥脯氨酸含量, 計(jì)算公式如下：

式中：X——測(cè)定所得羥脯氨酸質(zhì)量濃度, μg/mL；

V樣——樣品管中所含樣品體積, 0.2 mL；

N——稀釋倍數(shù), 800；

W——樣品質(zhì)量, 10 mg。

2 結(jié)果與分析

2.1 膠原肽提取單因素試驗(yàn)

（1）加酶量對(duì)提取率的影響。

加酶量對(duì)魚皮膠原肽提取率的影響見圖1。

圖1 加酶量對(duì)魚皮膠原肽提取率的影響

由圖1可知, 膠原肽提取率隨酶液加入量的增加而增加, 當(dāng)酶液加入量為2.0 mL時(shí)提取率最高, 之后略有下降, 說(shuō)明適當(dāng)?shù)拿笣舛扔欣谀z原肽的提取。因此, 選擇1.5, 2.0, 2.5 mL作為正交水平。

（2）酶解時(shí)間對(duì)提取率的影響

酶解時(shí)間對(duì)魚皮膠原肽提取率的影響見圖2。

由圖2可知, 隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng), 提取率逐漸增加, 至5 h時(shí)達(dá)到最高, 再延長(zhǎng)酶解時(shí)間, 提取率變化不大, 可能是因?yàn)殚L(zhǎng)時(shí)間保溫對(duì)酶活性有一定影響。因此, 選擇4, 5, 6 h作為正交水平。

圖2 酶解時(shí)間對(duì)魚皮膠原肽提取率的影響

（3）酶解溫度對(duì)提取率的影響。

酶解溫度對(duì)魚皮膠原肽提取率的影響見圖3。

由圖3可知, 隨著酶解溫度的提高, 魚皮膠原肽提取率逐漸增加, 至50℃達(dá)到最高, 說(shuō)明該酶的最適溫度約為50℃, 溫度偏低影響酶活力的發(fā)揮, 而溫度偏高則會(huì)造成酶一定程度的變性失活。因此, 選擇45, 50, 55℃作為正交水平。

圖3 酶解溫度對(duì)魚皮膠原肽提取率的影響

（4）pH值對(duì)提取率的影響

pH值對(duì)魚皮膠原肽提取率的影響見圖4。

圖4 pH值對(duì)魚皮膠原肽提取率的影響

由圖4可知, 當(dāng)酶解體系pH值為7.0時(shí)提取率最高, 說(shuō)明該酶的最適pH值約為7.0, pH值偏低或偏高都會(huì)造成酶變性, 降低酶活力。因此, 選擇pH值6.0, 7.0, 8.0作為正交水平。

2.2 正交試驗(yàn)優(yōu)化酶解條件

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果, 利用L9（34）正交試驗(yàn)確定影響膠原肽提取率的主要因素和水平。

膠原肽提取正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 膠原肽提取正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)極差分析, 4個(gè)因素對(duì)膠原肽提取率的影響大小為加酶量＞pH值＞酶解時(shí)間＞酶解溫度。根據(jù)k值分析, 最優(yōu)組合為A2B2C3D1, 即加酶量2.0 mL（0.2 mL/g魚皮）, 酶解時(shí)間5 h, 酶解溫度55℃, pH值6.0。在最優(yōu)條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn), 膠原肽提取率為28.51%（濕質(zhì)量）。

2.3 膠原肽的理化指標(biāo)和污染物限量評(píng)價(jià)

根據(jù)GB 31645—2018《膠原蛋白肽》的規(guī)定, 對(duì)本法制備的膠原肽的理化指標(biāo)和污染物限量進(jìn)行評(píng)價(jià)。

膠原肽粉與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)部分理化指標(biāo)的比較見表3, 膠原肽粉與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)污染物限量的比較見表4。

表3 膠原肽粉與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)部分理化指標(biāo)的比較

表4 膠原肽粉與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)污染物限量的比較/mg·kg-1

通過比較, 采用SCAU膠原蛋白復(fù)合酶酶解制備的膠原肽的理化指標(biāo)和污染物限量均符合GB 31645—2018的標(biāo)準(zhǔn)。總氮含量高, 說(shuō)明該法制備的膠原肽中蛋白質(zhì)為主要成分, 純度高、含水量低, 利于膠原肽的長(zhǎng)期保存。

2.4 膠原肽的相對(duì)分子量分布

膠原肽飛行時(shí)間質(zhì)譜圖見圖5。

由圖5可知, 經(jīng)酶解和膜分離后得到的膠原肽分子量主要分布于1195.1～2775.9 Da, 主要集中于1879.0, 1609.7, 1387.5 Da。說(shuō)明該酶的酶解能力較強(qiáng), 且酶解后通過微濾和超濾可有效分離分子量較小的膠原肽, 符合GB 31645—2018中對(duì)膠原肽分子量的要求。膜過濾方法對(duì)膠原肽的結(jié)構(gòu)和活性無(wú)影響, 利于提高產(chǎn)品品質(zhì)。

圖5 膠原肽飛行時(shí)間質(zhì)譜圖

2.5 膠原肽羥脯氨酸含量測(cè)定

羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖6。

圖6 羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

測(cè)得樣品吸光度為0.338±0.005, 經(jīng)計(jì)算, 膠原肽羥脯氨酸含量為8.46%。

3 結(jié)論

以魚皮為原料, 通過SCAU膠原蛋白酶酶解、微濾、超濾和冷凍干燥后, 制備膠原肽。最優(yōu)酶解條件為加酶量0.2 mL/g魚皮, 酶解時(shí)間5 h, 酶解溫度55℃, pH值6.0, 膠原肽提取率為28.51%（濕質(zhì)量）。理化分析表明, 該膠原肽總氮含量為15.4%, 灰分含量為0.1%, 水分為1.1%, 鉛和鎘含量均小于0.02 mg/kg, 總砷和鉻含量均小于0.1 mg/kg, 總汞含量小于0.02 mg/kg。膠原肽的相對(duì)分子量主要集中于1879.0, 1609.7, 1387.5 Da, 羥脯氨酸含量為8.46%。理化指標(biāo)和污染物限量均符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。