響應(yīng)面優(yōu)化超聲提取蒲公英多糖及其抗氧化性的研究

劉嘯宇, 王秀風(fēng), 后夢情, 江思雨, 姚 坤, 2, 吳 蕭, 2

（宿州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院, 安徽宿州 234200）

蒲公英（Herba Taraxaci）是桔梗目菊科植物, 在一系列的藥食同源類植物中屬于多年生宿根型。在2000年時我國的蒲公英栽培種類就有70種[1], 分布相對較多的地區(qū)為我國的西南、西北區(qū)[2]。其中, 有27種蒲公英可以藥用, 藥用蒲公英組（Taraxacum officinale）主要應(yīng)用于藥用方面, 如蒙古蒲公英、熱河蒲公英等[3]。蒲公英中含有多種對人體有益的天然化學(xué)成分, 如蒲公英醇、胡蘿卜素類、植物甾醇類、黃酮類、果膠等。

多糖作為植物蒲公英的重要構(gòu)成組分, 在不同部位的多糖含量也是不一樣的, 有關(guān)研究表明, 同一株蒲公英不同部位的多糖含量為根＞花＞葉[4], 但根中所含的多糖大多屬于貯存性多糖, 而葉與花中的多糖功能性較強。多糖的提取方法也有很多種, 如熱水浸提法[5]、超聲波提取法[6]、微波提取法[7]等。其中, 超聲波提取分離的方法在中藥類植物成分的提取中應(yīng)用較為廣泛。試驗旨在研究功能性多糖的抗氧化性, 以蒲公英葉為材料, 采用超聲波提取法, 通過單因素試驗, 再利用響應(yīng)面分析軟件確定蒲公英多糖超聲波提取的最佳試驗工藝。由于蒲公英多糖具有抗突變、抗疲勞和提高免疫[8-9]等的重要作用, 而試驗又旨在探索其抗氧化作用。因此, 利用在最佳工藝水平下提取的蒲公英多糖, 研究其對DPPH自由基和羥基自由基（·OH）的清除效果, 探索其抗氧化活性, 以便為更好地開發(fā)利用蒲公英多糖資源提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 儀器設(shè)備

HH-30B型多功能粉碎機, 鞏義市宏華儀器設(shè)備工貿(mào)有限公司產(chǎn)品；722型可見分光光度計, 上海元析儀器有限公司產(chǎn)品；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器, 昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；JA5003N型電子天平, 上海菁海儀器有限公司產(chǎn)品；HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋, 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 主要試劑

干蒲公英葉, 購自宿州市中藥房；葡萄糖標準品、5 %苯酚、DPPH（分析純）, 國藥集團化學(xué)試劑有限公司提供；無水乙醇（分析純）, 安徽安特食品股份有限公司提供；水楊酸（分析純）, 天津市大茂化學(xué)試劑廠提供；硫酸亞鐵（分析純）, 上海展云化工有限公司提供；30%過氧化氫（分析純）, 西騰化工股份有限公司提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準曲線的繪制

準確稱取50.00 mg葡萄糖標準品放入燒杯中, 加適量蒸餾水溶解, 轉(zhuǎn)移到50 mL的容量瓶并定容至刻度線, 配制成質(zhì)量濃度1 mg/mL的葡萄糖溶液待用。從已配制的葡萄糖溶液中分別吸取0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.2 mL依次放入試管中, 并用蒸餾水補足使各試管中溶液達到2.0 mL, 采用硫酸-苯酚法測定波長490 nm處的吸光度。記錄數(shù)據(jù)繪制標準曲線并得到標準回歸方程, 其中橫坐標是葡萄糖溶液質(zhì)量濃度, 縱坐標是吸光度。

1.2.2 樣品液的制備

粉碎干蒲公英葉, 用80目篩過篩備用。稱取1.0 g的蒲公英粉置于錐形瓶中, 加入適量蒸餾水, 超聲提取, 提取液置于離心機中進行離心取上清液, 即得到多糖樣品液。

1.2.3 蒲公英多糖得率的計算

多糖含量的測定采用苯酚-硫酸法[10], 公式如下：

式中：C——蒲公英多糖的質(zhì)量濃度, mg/mL；

F——多糖提取液的稀釋倍；

V——多糖溶液體積, mL；

m——稱取的蒲公英粉質(zhì)量, g。

1.2.4 蒲公英多糖提取的單因素試驗設(shè)計

分別考查超聲溫度（50, 55, 60, 65, 70℃）、提取時間（20, 30, 40, 50, 60 min）、超聲功率（70, 90, 110, 130, 150 W）、料液比（1∶30, 1∶35, 1∶40, 1∶45, 1∶50）對蒲公英多糖提取率的影響, 將每次得到的提取液進行離心取上清液獲得蒲公英多糖的樣品液, 取適量的樣品液按上述1.2.3操作, 根據(jù)1.2.3中的公式計算多糖含量。

1.2.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計

利用Design Expert 8.0.6軟件中的Box-benhnken設(shè)計法, 設(shè)計四因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化分析, 并將4個因素的試驗編碼為-1, 0, 1這3個水平, 試驗的響應(yīng)值選擇蒲公英多糖的提取率（Y）。

試驗因素與水平設(shè)計見表1。

表1 試驗因素與水平設(shè)計

1.2.6 蒲公英多糖抗氧化性的研究

（1）對DPPH自由基清除力的測定。參照李敏等人[11]的方法, 采用DPPH法進行測定。根據(jù)1.2.5的響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果, 并在此條件下提取蒲公英多糖, 將提取液的質(zhì)量濃度配制為1 mg/mL。首先把多糖提取液按比例稀釋成質(zhì)量濃度為1.5, 2.5, 3.5, 4.5, 5.5 mg/mL的一系列樣品液。接著配置DPPH溶液, 準確稱量DPPH 7.00 mg, 用無水乙醇溶解, 在100 mL容量瓶中定容, 放置備用。分別吸取DPPH溶液2.0 mL于各試管中, 再加入1.5 mL不同質(zhì)量濃度的多糖提取液, 最后加0.5 mL蒸餾水, 搖勻, 置于暗處反應(yīng)30 min, 于波長517 nm處測定吸光度。蒲公英多糖對DPPH自由基的清除率計算公式：

式中：A0——用蒸餾水代替多糖溶液的吸光度；

A1——用蒸餾水代替DPPH-乙醇溶液的吸光度；

A2——不同梯度多糖溶液的吸光度。

（2）對羥基自由基清除力的測定。參考付學(xué)鵬等人[12]的方法, 采用水楊酸比色法。根據(jù)1.2.5的響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果, 并在此條件下提取蒲公英多糖, 將提取液的質(zhì)量濃度配制為1 mg/mL。再用蒸餾水將配制好的多糖提取液按比例稀釋為不同質(zhì)量濃度0.03, 0.06, 0.09, 0.12, 0.15 mg/mL的樣品溶液。在各試管中依次加入濃度8 mmol/L FeSO4溶液2.0 mL、8 mmol/L水楊酸溶液2.0 mL、不同質(zhì)量濃度的多糖提取液2.0 mL, 最后加入2.0 mL 8 mmol/L的H2O2溶液, 待各試管中溶液反應(yīng)10 min后, 于510 nm處測定吸光度。蒲公英多糖對羥基自由基清除率計算公式：

式中：A0——用蒸餾水代替多糖溶液所測吸光度；

A1——不同質(zhì)量濃度多糖提取液所測吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線的繪制

將配置的不同質(zhì)量濃度的葡萄糖標準品溶液, 使用可見分光光度計于波長490 nm處測定吸光度, 以葡萄糖標準液質(zhì)量濃度作為橫坐標, 吸光度作為縱坐標繪制成標準曲線。標準曲線回歸方程為：

葡萄糖標準曲線見圖1。

圖1 葡萄糖標準曲線

2.2 蒲公英多糖提取的單因素試驗結(jié)果

2.2.1 超聲溫度對蒲公英多糖得率的影響

超聲溫度對蒲公英多糖得率的影響見圖2。

圖2 超聲溫度對蒲公英多糖得率的影響

由圖2可知, 剛開始蒲公英多糖得率隨超聲溫度升高而逐漸增大, 當溫度達到60℃時, 多糖得率同樣達到最高值。而當溫度大于60℃時, 多糖得率又逐漸下降。這是因為當溫度過高時, 空化作用減弱且過高的溫度也會影響多糖活性。因此, 多糖提取溫度應(yīng)選定60℃左右。

2.2.2 超聲時間對蒲公英多糖得率的影響

超聲時間對蒲公英多糖得率的影響見圖3。

圖3 超聲時間對蒲公英多糖得率的影響

由圖3可知, 超聲時間為20～40 min時, 蒲公英多糖得率逐漸升高, 在40 min時得率達到頂峰, 后期的蒲公英多糖得率隨時間延長而下降。這可能是由于長時間的提取會破壞多糖的結(jié)構(gòu), 造成多糖的損失, 從而影響多糖得率。因此, 蒲公英多糖提取超聲時間應(yīng)該控制在40 min左右。

2.2.3 超聲功率對蒲公英多糖得率的影響

超聲功率對蒲公英多糖得率的影響見圖4。

圖4 超聲功率對蒲公英多糖得率的影響

由圖4可知, 當功率達到110 W時, 多糖得率最大。伴隨著超聲功率的不斷升高, 多糖得率開始不斷下降, 且趨勢非常明顯。這是因為在過高的功率作用下多糖分子結(jié)構(gòu)遭到破壞, 造成溶液中多糖量的損失。因此, 超聲萃取蒲公英多糖時的超聲功率控制在110 W左右。

2.2.4 料液比對蒲公英多糖得率的影響

料液比對蒲公英多糖得率的影響見圖5。

圖5 料液比對蒲公英多糖得率的影響

由圖5可知, 隨著料液比的增加蒲公英多糖得率先上升后下降, 以1∶45的料液比為轉(zhuǎn)折點, 多糖得率開始下降。當料液比較小時, 蒲公英粉不能在溶劑中充分溶解, 導(dǎo)致多糖得率值不大, 隨著料液比中溶劑量的增多, 樣品與其接觸就更充分, 多糖的溶出量增大, 從而使多糖得率增加。但過大的料液比會相應(yīng)的增加成本和時耗。因此, 料液比選擇在1∶45左右。

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝

2.3.1 響應(yīng)模型建立與分析

根據(jù)四因素三水平設(shè)計的29組試驗, 得出試驗數(shù)據(jù)結(jié)果。

Box-behnken試驗設(shè)計和響應(yīng)值見表2。

對表2數(shù)據(jù)進行擬合, 得到二次多項式回歸模型方程為：

表2 Box-behnken試驗設(shè)計和響應(yīng)值

回歸模型方差表（ANOVA）見表3。

由表3可知, 決定系數(shù)（R2）為0.8009和調(diào)整后的決定系數(shù)（R2Adj）為0.6018, 這2個系數(shù)反映了實際測量值與預(yù)測值之間的相關(guān)性。而模型中的失擬項Prob＞F的值為0.4455, 大于0.05, 則表明此模型的擬合度良好, 完全可以采取模型方程取代試驗真實點來對分析和預(yù)測試驗值, 且一次項系數(shù)X1對于蒲公英多糖超聲提取的影響是極顯著, 而系數(shù)X2、X4僅為影響顯著。比較F值可以得出, 各單因素對蒲公英多糖得率的影響力強弱為超聲溫度＞超聲時間＞料液比＞超聲功率。

表3 回歸模型方差表（ANOVA）

2.3.2 響應(yīng)面交互作用的分析

（1）超聲溫度與其他因素間的交互作用。

超聲溫度和超聲時間的等高線和3D曲面圖見圖6, 超聲溫度和超聲功率的等高線和3D曲面圖見圖7, 超聲溫度和液料比的等高線和3D曲面圖見圖8。

圖6 超聲溫度和超聲時間的等高線和3D曲面圖

由圖6～圖8可知, 超聲溫度分別與超聲時間、超聲功率、料液比間兩兩作用對多糖得率的影響。在圖6中, 由于其3D曲面圖整體坡度較陡, 即代表超聲溫度與超聲時間相互作用對試驗結(jié)果影響較大。蒲公英多糖得率的最佳條件為超聲溫度55～65℃, 超聲時間35～45 min。而圖7、圖8中曲面圖較為平坦, 表明這兩對因素交互作用對多糖得率的影響沒有圖6顯著。

圖7 超聲溫度和超聲功率的等高線和3D曲面圖

圖8 超聲溫度和料液比的等高線和3D曲面圖

（2）超聲時間與超聲功率、料液比間的交互作用。

超聲時間和超聲功率的等高線和3D曲面圖見圖9, 超聲時間和液料比的等高線和3D曲面圖見圖10。

由圖9、圖10可知, 2組圖的3D曲面圖都是彎曲度較大的, 說明超聲時間與超聲功率、料液比對多糖得率有一定程度影響。圖中多糖得率較大的點從時間上看在35～45 min, 其中一個超聲功率在106～122 W, 另一個的料液比在1∶39～1∶45。

圖9 超聲時間和超聲功率的等高線和3D曲面圖

圖10 超聲時間和料液比的等高線和3D曲面圖

（3）超聲功率與料液比間的交互作用。

超聲功率和料液比的等高線和3D曲面圖見圖11。

由圖11可知, 適宜提取蒲公英多糖的條件在超聲功率108～122 W、料液比為1∶39～1∶45。但由于這組圖中的3D曲面圖更接近于平面圖, 所以在多糖提取時超聲功率與料液比間的交互作用對其提取率影響不大。

圖11 超聲功率和料液比的等高線和3D曲面圖

2.3.3 最優(yōu)工藝的調(diào)整和驗證

根據(jù)Design Expert 8.0.6軟件中的模型得到4個變量的最優(yōu)值, 分別是超聲溫度63.97℃, 超聲時間41.13 min, 超聲功率115.16 W, 料液比1∶43.21（g∶mL）, 該模型預(yù)測在最優(yōu)條件下蒲公英多糖得率為2.47 %。為驗證響應(yīng)面優(yōu)化得出的試驗方法是否可行, 對最優(yōu)條件進行調(diào)整, 在調(diào)整后的最優(yōu)條件下提取。

試驗結(jié)果驗證見表4。

表4 試驗結(jié)果驗證

同樣, 把超聲波清洗器調(diào)到最優(yōu)水平, 3次重復(fù)試驗進行提取, 測定求出多糖得率, 結(jié)果表明在最優(yōu)條件下多糖得率為2.32%, 與預(yù)測數(shù)據(jù)較為接近, 可以驗證模型的可行性。

2.4 蒲公英多糖抗氧化性研究結(jié)果

2.4.1 對DPPH自由基清除能力的測定

以多糖的不同質(zhì)量濃度梯度為橫坐標, 于波長517 nm處測定吸光度并計算清除率。

不同多糖質(zhì)量濃度對DPPH自由基的清除能力見圖12。

圖12 不同多糖質(zhì)量濃度對DPPH自由基的清除能力

由圖12可知, 蒲公英多糖對DPPH自由基具有明顯的清除效果, 并且其清除能力隨多糖質(zhì)量濃度增大而上升, 當多糖質(zhì)量濃度達到1.4 mg/mL時, 清除率已達到82.43%清晰的表明多糖有較好的抗氧化性。

2.4.2 對羥基自由基清除能力的測定

以多糖的不同質(zhì)量濃度梯度為橫坐標, 于波長510 nm處測定吸光度并計算清除率。

不同多糖質(zhì)量濃度對羥基自由基的清除能力見圖13。

圖13 不同多糖質(zhì)量濃度對羥基自由基的清除能力

由圖13可知, 蒲公英多糖的質(zhì)量濃度與其對羥自由基的清除力呈正相關(guān), 隨多糖質(zhì)量濃度的上升, 清除效果明顯增強。當質(zhì)量濃度為4.5 mg/mL時, 清除率為43.79%；在4.5～5.0 mg/mL時, 多糖對羥自由基的清除率上升不明顯, 基本趨于穩(wěn)定。

3 結(jié)論

試驗利用Box-behnken Design（BBD）優(yōu)化超聲波提取蒲公英多糖的工藝條件, 結(jié)果表明多糖得率在超聲溫度63.97℃, 超聲時間41.13 min, 超聲功率115.16 W, 料液比1∶43.21（g∶mL）的條件下提取最佳, 多糖提取率達到2.47%。而在實際操作中, 對響應(yīng)面軟件給出的最優(yōu)條件進行適當調(diào)整, 在超聲溫度64℃, 超聲時間41 min, 超聲功率115 W, 料液比1∶43（g∶mL）下, 多糖得率為2.32%與預(yù)測值接近。

通過多糖對DPPH自由基、羥基自由基的清除率反映其顯著的抗氧化能力, 在多糖質(zhì)量濃度達到1.4 mg/mL時, 對DPPH自由基的清除率達到82.43%；當質(zhì)量濃度為4.5 mg/mL時, 清除率為43.79%。從數(shù)據(jù)中可以明顯看出, 蒲公英多糖所具有的抗氧化性, 對于開發(fā)利用蒲公英葉資源提供參考。但試驗在多糖提取時缺少蒲公英多糖的分離純化步驟, 僅進行了多糖的粗提取, 并且沒有根據(jù)蒲公英的成長階段、生產(chǎn)地點等方面分類進行精細研究, 還需進一步研究。