改良薄型子宮內膜小鼠模型的建立及初步鑒定

吳媛霞，劉俊芬，康榮彥，崔向榮，武學清，劉艷玲

(山西省兒童醫院，山西省婦幼保健院，山西 太原 030013)

子宮內膜厚度與容受性是體外受精—胚胎移植妊娠成敗的關鍵。其中，一定的子宮內膜厚度是胚胎著床的基本條件，子宮內膜過薄可導致胚胎種植率明顯降低[1-4]。子宮內膜薄常見的全身性原因有雌激素水平低、孕激素水平不足、存在排卵障礙和缺乏生長激素等，也有局部的原因，例如內膜損傷、粘連和缺失等。單純內分泌因素造成的子宮內膜薄，臨床上可以用激素調整，適量的雌激素、孕激素可以在一定程度上增加子宮內膜的厚度，改善子宮內膜薄的癥狀。而局部原因，如內膜損傷、粘連和缺失多因為多次藥物流產，或者人工流產動作過重、感染等，都可能引起子宮內膜變薄，甚至嚴重損傷子宮內膜，這種情況下一般需要很長時間恢復，有的患者甚至無法恢復。目前臨床上治療薄型子宮內膜的方法很多，包括西藥、手術和傳統中醫療法，但無特效方法。非正常生理性子宮內膜薄治療需根據病因補充激素或進行手術治療，各家治療效果報道不一，對頑固性的薄型內膜治療效果不明顯。由于倫理等問題，某些實驗性治療方法及病理機制的探討難以直接在患者體內進行，而有效的薄型子宮內膜動物模型可以為研究其病理特點及探索有效治療方法提供實驗研究的基礎。

目前，國內外對于建立薄型子宮內膜的動物模型均有研究和報道。模型有大鼠[5-7]、小鼠[8-9]、新西蘭兔[10]、比格犬[11]及恒河猴[12]；方法有機械損傷、感染損傷、缺血損傷、熱損傷、化學損傷、光學損傷等。其中無水乙醇灌注SD大鼠宮腔建立薄型子宮內膜模型[6]使用最多最廣泛。張引紅等[13]借鑒了該方法，選用雌性C57BL/6J完成了小鼠薄型子宮內膜模型。本實驗在該方法上進行改良，將無水乙醇通過陰道灌注進入小鼠宮腔，利用無水乙醇的脫水及蛋白質變性作用，對內膜進行損傷，完成小鼠薄型子宮內膜模型的改良。

1 實驗動物選擇與造模方法

1.1 實驗動物來源

性成熟的有正常動情周期的健康雌性ICR小鼠(清潔級，30只，鼠齡6～8周，體質量25～35 g)由山西醫科大學實驗動物中心提供。飼養條件：山西醫科大學屏障環境動物實驗室，室溫23～27 ℃，日溫差不超過3 ℃，濕度50%～60%，光照明暗時間各為12 h，自由獲取食物和水。

1.2 方法與步驟

1.2.1 分組

將納入實驗的小鼠按照隨機數字表分為對照組、模型1組和模型2組，每組10 只。對照組：經陰道宮腔注射生理鹽水；模型1組：開腹宮腔注射無水乙醇，0.9%氯化鈉溶液沖洗2次。模型2組：為改良模型組，經陰道宮腔注射無水乙醇，0.9%氯化鈉溶液沖洗2次。

1.2.2 造模步驟

模型1組：擇動情期行造模術，以0.2 mL/100 g，5%水合氯醛腹腔注射麻醉動物，生效后用膠布仰臥位固定好四肢。小鼠沿腹部正中白線處剪毛，腹部用75%乙醇進行消毒，鑷子提起皮膚，剪刀沿腹中線開腹，逐層分離，各層切口約1 cm。進入腹腔，膀胱后方可見粉紅色V狀子宮，粗細均勻。分離子宮(小鼠子宮為一個Y型子宮，主要造模選取上部分V段兩側，暴露出子宮的近陰道端及卵巢端即可)，用血管鉗鉗夾子宮近端和遠端，將注射器針頭輕輕插入小鼠陰道一側子宮近端，用無菌鹽水紗布保護周圍組織以防無水乙醇外溢。注射器針頭進入宮腔，且與子宮縱軸保持平行，于子宮近陰道端緩慢注入0.1 mL無水乙醇，保持宮腔處于充盈狀態，同時盡量保證乙醇不外溢。針頭停留4～5 min后緩慢將乙醇抽吸出來，保持注射器針頭在宮腔內，輕輕擠壓出殘留的乙醇，并用生理鹽水沖洗1～2次。另一側子宮采用同樣方法處理(見圖1a)，常規給予青霉素粉劑適量均勻涂抹在小鼠腹部創面，逐層關腹。

模型2組：模型1組所需無水乙醇藥量為每只0.2 mL，推算模型2組通過陰道灌注95%乙醇造模注射乙醇藥量為每只0.2～0.3 mL。為了測試經陰道灌注無水乙醇是否會經輸卵管流入小鼠腹腔引起損傷，先用美蘭經陰道灌注子宮，用靜脈留置針(退內芯4～5 mm)沿小鼠陰道順勢插入小鼠子宮近端(雌性小鼠子宮角與輸卵管連接，輸卵管呈盤曲狀，左右各一條，前端喇叭口朝向卵巢，后端緊接于子宮)。固定留置針，緩慢注入美蘭，保持宮腔處于充盈狀態，共需推注0.2～0.3 mL美蘭(需操作者推注手感略有阻力時立即停止)，盡量保證美蘭不經陰道外溢，切開小鼠腹壁皮膚，暴露雙側子宮，觀察可見雙側子宮充盈呈現藍色，腹腔內無美蘭流出(見圖1b和圖1c)。

(a) (b) (c)

對照組：用靜脈留置針(退內芯約4～5 mm)沿小鼠陰道順勢插入小鼠子宮近端，固定留置針，緩慢注入0.9%氯化鈉注射液0.2～0.3 mL，針頭停留4～5 min后緩慢將其抽吸出來。所有小鼠造模后正常清潔飼養3個動情周期，過量麻醉處死小鼠，再以同樣方式行剖腹手術取雙側子宮，以40 g/L多聚甲醛固定小鼠子宮，包埋后切片(厚度4 μm)，采用蘇木精-伊紅(HE)染色，在正置光學顯微鏡下(Nikon Eclipse Ci，日本尼康)觀察。

1.3 薄型子宮小鼠的鑒定

1.3.1 子宮外觀觀察

術后第3 個動情期取樣，對是否有腹腔粘連、宮腔粘連、子宮外觀形態等進行觀察。

1.3.2 子宮內膜厚度測量

常規HE染色后，采用正置光學顯微鏡圖像分析系統測量子宮內膜厚度。小鼠子宮由內至外分為漿膜層、肌層、內膜層，子宮內膜厚度選取子宮肌層到子宮腔距離的平均值。

1.3.3 組織形態學觀察

常規HE染色后，在正置光學顯微鏡下觀察子宮內膜腺體結構及數量、子宮內膜血管分布情況、各層細胞形態學改變等。

1.4 統計學方法

2 結 果

2.1 實驗小鼠基本情況

造模過程中，對照組無小鼠死亡；模型1組和模型2組各有1只小鼠死亡，補齊小鼠繼續后續實驗，兩組其余存活小鼠飲食正常，精神狀態良好，動情周期規律。對照組與模型1組、模型2組小鼠的一般狀況相比差異無統計學意義。分析原因：模型1組小鼠死亡與麻醉手術操作過程中失溫或小鼠自身體質差有關。模型2組小鼠死亡是由于靜脈留置針從陰道插入過深，刺破子宮壁導致無水乙醇漏入腹腔所致。

2.2 造模手術過程觀察

模型1組術前小鼠子宮外觀呈粉紅色，有光澤，注射過程中損傷側子宮充盈明顯，子宮腔膨脹增粗、顏色偏白、彈性降低、質地變硬。模型2組術前、術中、術后均未見明顯異常，個別小鼠在灌注過程中可見下腹部略隆起。

2.3 子宮內膜厚度測量

對照組子宮內膜厚度為(426.21±31.27) μm，模型1組為(145.50±23.36) μm，模型2組為(209.46±24.59) μm。單因素方差分析結果顯示：三組比較差異有統計學意義(χ2=305.025，P<0.01)。對照組與模型1組相比差異有統計學意義(t=22.738，P<0.01)；對照組與模型2組相比差異有統計學意義(t=17.228，P<0.01)；模型2組與模型1組相比差異有統計學意義(t=5.963，P<0.01)(見圖2)。

(a) (b) (c)

2.4 組織形態學觀察

與對照組相比，模型1組、模型2組子宮內膜層明顯變薄，宮腔隙增大，其中模型1組變化更明顯；內膜上皮及腺上皮細胞扁平化，腺體、血管稀疏(見圖3)。

(a) (b) (c)

3 討 論

注射無水乙醇損傷子宮內膜建立薄型子宮內膜動物模型是高紅等[14]最先建立的SD大鼠薄型子宮內膜模型，其表現符合內膜生長受限的特點，但術后大鼠存活率為70%，常常造成大鼠腹腔嚴重粘連。研究者[14]在此基礎上采用血管鉗鉗夾子宮近端和遠端，用生理鹽水紗布墊入腹腔保護周圍臟器，以避免損傷粘連，大大提高了造模后存活率，同時將該方法應用于小鼠模型獲得成功。目前實驗動物模型多是采取開腹宮腔灌注造模，缺點是操作復雜，可能引起小鼠感染甚至死亡，具有創傷性，因此作者結合臨床觀察，經過多次文獻研究、預實驗、反復討論與分析，最終確定創立了一種改良方法，創傷性較小。在技術熟練的情況下通過陰道灌注無水乙醇造模，雙側子宮均可成功灌注無水乙醇，該方法同時可以陰道給藥治療，避免開腹對小鼠造成的傷害，降低了感染率，與臨床發病過程更相似。本研究模型2組子宮內膜厚度與對照組相比明顯變薄，同時發現模型1組子宮內膜厚度與模型2組相比，子宮內膜明顯更薄，差異有統計學意義。分析其原因，與模型1組采用血管鉗鉗夾子宮近端和遠端后注射無水乙醇導致子宮過度充盈或模型2組無水乙醇灌注后子宮充盈不足有關。經上述實驗證實，通過經陰道向宮腔注射無水乙醇可成功建立薄型子宮內膜的ICR小鼠模型，為臨床研究薄型子宮內膜的病理機制、修復機制，尋求有效治療方法，提供了理想的動物模型。