丙戊酸鈉抑制脯氨酰內肽酶活性對非酒精性脂肪性肝病進展的影響

李夢婷，蔣黛西，張建斌，魏建東，陳長喜，李紅亮

1.寧波大學附屬人民醫院 消化內科，浙江 寧波 315000；2.上海交通大學醫學院附屬新華醫院 消化內科，上海 200092；3.上海市寶山區中西醫結合醫院 急診科，上海 201900

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD）在全球患病人數不斷增加，非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis, NASH）是其嚴重類型[1]。脯氨酰內肽酶（prolyl endopeptidase, PREP）是一種能特異性水解神經活性肽、小肽類激素和多種細胞因子的絲氨酸蛋白酶，在肝臟中活性較高[2-3]。筆者前期體內體外實驗均證實肝細胞脂肪變時伴PREP活性升高[2-4]，抑制PREP活性[2]或PREP表達缺失[5]均可抑制肝細胞脂肪變，提示抑制PREP對NAFLD進展可能有保護作用。丙戊酸及其鈉鹽是目前世界上最常用的抗癲癇藥物，有研究稱長期服用丙戊酸對人體肝功能有一定的損害作用[6]，但同時丙戊酸有顯著的PREP活性抑制作用[7-8]，它對NAFLD進展的影響目前鮮見報道。本研究采用高脂高膽固醇飲食構建小鼠NAFLD模型，并用具有PREP活性抑制功能的丙戊酸鈉進行干預，觀察其對NAFLD進展的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：42 只雄性7～8 周齡，體質量18～20 g，無特殊病原體野生型C57BL/6J小鼠購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，生產許可證：SCXK（滬）2012-0002。

1.1.2 主要試劑：高脂高膽固醇飼料（10%豬油+2%膽固醇+88%基礎飼料，總熱卡4.8 kcal/g）購自南通特洛菲飼料科技有限公司；丙戊酸鈉購自荷澤方明藥業集團股份有限公司；底物Suc-Gly-Pro-AMC購自瑞士BaChem公司；7-氨基-4-甲基香豆素（7-amino-4-methylcoumarin, AMC）購自美國Sigma-Aldrich公司；蘇木精-伊紅（HE）試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司；兔抗小鼠PREP抗體購自美國Abcam公司；其他抗體均購自上海碧云天生物科技研究所。RT-qPCR和TRIzol試劑盒均購自日本Takara公司。

1.2 方法

1.2.1 動物模型制備：用標準飼料適應性飼養小鼠1周后，將小鼠分為對照組（15只）、模型組（10只）和干預組（17只），對照組喂以普通飼料，模型組和干預組喂以高脂飼料，8周后干預組給予0.4%丙戊酸鈉飲用水[9-10]，繼續干預8周后，隔夜禁食，次日稱量體質量，通過眼眶靜脈取血，頸椎脫臼處死小鼠，解剖留取肝組織和血清，保存于-80 ℃冰箱。

1.2.2 血生化指標測定：采用全自動生化分析儀檢測血清生化指標。

1.2.3 病理標本制備：取部分肝組織經4%多聚甲醛固定2 h后予石蠟包埋，制備切片，常規HE染色后置于光鏡下觀察肝組織形態。采用NAFLD活動度積分（NAFLD activity score, NAS）進行評分（0～8分），NAS≥5分可診斷NASH，NAS＜3分可排除NASH，處于兩者之間為NASH可能[11]。

1.2.4 肝組織中PREP活性測定：取100 mg小鼠肝組織，加入濃度為10 mmol/L，pH 7.4 的Tris-HCl 500 μL后均勻裂解，在4 ℃ 16 000×g的離心機中離心20 min。取10 μL上清液，加入到465 μL上述濃度Tris-HCl中，放置于30 ℃水浴箱中恒溫孵育30 min。后加入25 μL底物Suc-Gly-Pro-AMC（4 mmol/L），繼續放置于30 ℃水浴箱中恒溫反應60 min，用500 μL醋酸鈉緩沖液（1 mol/L，pH 4.2）終止反應。取100 μL終末反應液加入至96孔板中，用BioTek Synergy H4檢測終末反應液的熒光強度（激發波：360 nm，吸收波：460 nm）[12]。同時以AMC作為標準曲線，測定其熒光強度并計算終末反應液中AMC的濃度。用BCA法測定上清液中總蛋白濃度，各樣本中PREP酶活性的高低以每毫克蛋白每分鐘能水解產生的AMC量（pmol·min-1·mg-1）來表示。

1.2.5 肝組織中PREP mRNA測定：稱取50 mg肝組織，采用TRIzol法進行RNA提取并測定各組RNA濃度及純度，通過RT-qPCR法將mRNA反轉錄合成cDNA，利用cDNA進行熒光實時定量PCR擴增，設置3個復孔，以GAPDH為內參，計算PREP基因相對表達量，最終結果以RQ值（2-ΔΔCT）表示。各基因引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，GAPDH上游引物5’-TGC ACCACCAACTGCTTAG-3’，下游引物5’-GGATGCAGGGATG ATGTTC-3’；PREP上游引物5’-GACCACTGATTACGGGTG CT-3’，下游引物5’-AGAAGCATGGACGGGTACTG-3’。

1.2.6 肝組織中PREP蛋白檢測：提取肝組織內蛋白，采用BCA法測定各組蛋白濃度（BCA試劑購自上海碧云天生物科技研究所）。采用蛋白質印跡（Western blot）法對蛋白樣本進行電泳，將分離開的蛋白轉印至PVDF膜上，用脫脂牛奶封閉后加入一抗（兔抗小鼠PREP抗體，1:1 000），4 ℃孵育過夜，用1×TBST洗膜15 min×3次，加入辣根過氧化物酶標記的二抗孵育2 h，再用1×TBST洗膜15 min×3次，采用增強化學發光法顯色。以β-Actin作為內參，用Image Lab軟件分析條帶灰度值，并計算目的蛋白的相對表達量。

1.3 統計學處理方法 采用SPSS23.0軟件進行分析。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 小鼠體質量、肝指數和睪脂指數比較 模型組小鼠體質量、肝指數、睪脂指數與對照組相比均顯著升高（P＜0.05）；干預組小鼠肝指數與模型組相比顯著下降（P＜0.05）。見表1。

表1 3組小鼠體質量、肝指數和睪脂指數比較（±s）

表1 3組小鼠體質量、肝指數和睪脂指數比較（±s）

與對照組比：aP＜0.05；與模型組比：bP＜0.05

?

2.2 小鼠血清生化指標的比較 除谷草轉氨酶（AST）外，模型組小鼠血清總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白（LDL）、甘油三酯（TG）、谷丙轉氨酶（ALT）、堿性磷酸酶（ALP）、空腹血糖（FBG）、胰島素等均顯著高于對照組（P＜0.05）；干預組小鼠血清TC、TG、ALT較模型組顯著下降（P＜0.05），LDL、AST、ALP、FBG、胰島素等與模型組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 3組小鼠血清生化指標比較（±s）

表2 3組小鼠血清生化指標比較（±s）

與對照組比：aP＜0.05；與模型組比：bP＜0.05

?

2.3 小鼠肝組織形態及病理學改變和NAS比較

2.3.1 肝臟大體形態：在相同曝光條件下，用同一背景板作襯墊，觀察解剖時小鼠在體肝臟外觀形態。可見對照組小鼠肝臟呈暗紅色，形態正常，質地較軟，被膜光滑，邊緣銳利，切面無油膩感；模型組小鼠肝臟呈現奶黃色，體積顯著增大，邊緣鈍圓，被膜緊張，切面明顯油膩感；干預組小鼠肝臟黃帶暗紅，體積較模型組略小，邊緣稍鈍，切緣稍油膩感。見圖1。

圖1 3組小鼠肝臟大體形態

2.3.2 肝臟HE染色：對照組小鼠具有完整的肝小葉結構，肝細胞內未見明顯的脂滴沉積；模型組小鼠肝組織發生廣泛大泡性脂肪變性，間質內炎癥細胞明顯浸潤，門脈區可見壞死灶及炎癥細胞聚集，同時易見氣球樣變性；干預組小鼠脂肪變性明顯減輕，可見個別炎性細胞浸潤，肝小葉和匯管區結構無明顯改變。見圖2。

圖2 3組小鼠肝臟組織HE染色結果（×200）

2.3.3 各組小鼠肝臟NAS比較：與對照組相比，模型組小鼠肝臟出現明顯的脂肪變性、炎癥及氣球樣變（P＜0.05），經丙戊酸鈉干預后，脂肪變性和炎癥明顯改善，NAS顯著下降（P＜0.05），見表3。

表3 3組小鼠肝臟NAS比較

2.4 3組小鼠肝組織內PREP mRNA及其蛋白表達和活性水平比較 模型組肝組織PREP mRNA及PREP蛋白活性均高于對照組（P＜0.05）；干預組肝組織PREP mRNA與模型組比較差異無統計學意義（P＞0.05）；干預組PREP蛋白活性相比于模型組降低（P＜0.05）；3組之間肝組織PREP蛋白相對表達量差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖3。

圖3 各組小鼠肝組織PREP表達及活性

3 討論

NAFLD是以肝細胞脂肪變性和炎癥改變為特征的臨床病理綜合征[13]。雖然目前已經認識到飲食、代謝、環境和遺傳等多種綜合因素共同導致的脂肪組織增生、胰島素抵抗和腸道微生態紊亂等是NAFLD的發病基礎[1，14]，但NAFLD特別是NASH的發病機制仍有待深入闡明。

丙戊酸鈉是目前癲癇類疾病治療的首選藥物，有研究顯示丙戊酸鈉可造成微泡性脂肪性肝炎和肝硬化。那么，在NAFLD患病率不斷增加的背景下，丙戊酸鈉是否仍可以安全地使用于NAFLD人群目前仍缺乏相關研究證據。

丙戊酸鈉具有顯著的PREP抑制活性[8]。PREP是一種在體內廣泛分布的絲氨酸蛋白酶，作為酶功能可特異性水解短肽鏈中脯氨酸殘基羧基端肽鍵[2]。在肝臟中，庫普弗細胞和肝細胞均可表達PREP蛋白，同時兩者是肝損傷修復的關鍵細胞[17]。研究表明，PREP參與調節炎癥反應和脂質積聚[2]，而肝內炎癥微環境和脂肪變性正是促使NASH發生發展的兩個基本要素[18]。已有研究顯示，抑制PREP活性能減輕中性粒細胞性炎癥，其機制可能與中性粒細胞趨化因子脯氨酰-甘氨酰-脯氨酸（proline-glycineproline, PGP）的生成減少有關[7]。PREP可與基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases, MMP）-8/9協同，水解膠原蛋白I/II產生三肽PGP[19]，PGP結合于中性粒細胞表面趨化性細胞因子CXC受體（CXC receptor, CXCR1和CXCR2），進而對中性粒細胞產生聚集效應[20]，抑制PREP或MMP活性及運用PGP拮抗劑均可顯著抑制中性粒細胞性炎癥。上述現象已在結腸炎[21]、動脈粥樣硬化[22]、慢性阻塞性肺病[23]等炎癥疾病中觀察到。

肝內炎癥微環境形成的原因是細胞免疫失衡，病理表現為多種炎癥細胞浸潤和激活[24]。肝內庫普弗細胞是較早認識的促進NAFLD發生發展的關鍵效應細胞之一，在小鼠NAFLD模型中，通過TOLL樣受體9 激活信號可刺激庫普弗細胞產生IL-1β，進而導致肝細胞脂肪變、炎癥和纖維化[25]。而近年來，中性粒細胞在NAFLD發生發展中的作用受到更為廣泛的關注。例如中性粒細胞釋放免疫調控蛋白LCN-2（Lipocalin-2）作用于巨噬細胞，促進其炎癥反應，并分泌LCN-2誘導自身表達CXCR2，進而激活ERK1/2導致多種促炎細胞因子的產生，促進中性粒細胞與巨噬細胞肝內浸潤，形成炎癥級聯放大反應[26]。我們團隊在先前的研究結果中觀察到PREP基因敲除小鼠肝組織中巨噬細胞和中性粒細胞聚集減少，眾多炎癥因子例如TNF-α、IL-6、IL-1β、LCN-2、CXCR2、ERK1/2表達顯著下降，同時PREP基因敲除小鼠肝臟中MMP-8、MMP-9和PGP的產生均較野生型小鼠明顯減少[5]。

本研究顯示，NAFLD模型鼠給予丙戊酸鈉處理后，脂肪變和炎癥沒有加重，反而得到一定程度改善，同時，肝內PREP活性也受到明顯抑制。結合團隊先前的研究結果，猜測丙戊酸鈉改善NAFLD小鼠肝臟炎癥可能與抑制PREP活性后MMP-8/9 和PGP產生減少有關，從而改善了中性粒細胞-巨噬細胞炎癥瀑布反應，進一步驗證上述炎癥因子、MMP-8/9和PGP表達量有助于回答以上問題。

有研究發現，PREP蛋白/活性下調后，能夠改善促進NAFLD/NASH發病的不良因素如肥胖[27]、糖代謝異常[28]等。此外，PREP活性與細胞脂質代謝密切相關。本團隊在先前的體內體外實驗中均發現肝細胞脂肪變時伴隨PREP活性升高，抑制PREP活性或PREP基因敲除后成脂相關基因如脂肪酸合成酶、過氧化物酶體增生物激活受體-γ、膽固醇調控元件結合蛋白-1c、乙酰輔酶A羧化酶等表達量顯著下調，肝細胞脂肪變性顯著改善[2，5]，因此我們推測，丙戊酸鈉改善NAFLD小鼠脂肪變性可能與調節脂質代謝相關基因有關，后續將進一步驗證上述基因表達量。

雖然已有研究報道丙戊酸鈉會導致胰島素抵抗及肝臟脂肪變性，促進NAFLD進展[29]，但本研究展示了不同的結果，這可能與丙戊酸鈉的劑量、作用方式、肝臟的微環境狀態有關，有待進一步驗證。

綜上所述，丙戊酸鈉在體內對肝臟的作用機制多樣，NAFLD小鼠應用0.4%丙戊酸鈉并未加重肝損傷，推測可能與NAFLD階段體內微環境改變有關，NAFLD患者應用丙戊酸鈉的安全性值得進一步研究。