黃芪-莪術誘導宮頸癌細胞凋亡的靶網絡識別及配伍機制探討

孫浩，鄭涌泉，徐夢瑾

浙江大學醫學院附屬婦產科醫院 藥劑科，浙江 杭州 310006

目前，在世界范圍內宮頸癌是第四大常見的女性癌癥，是嚴重威脅女性健康的惡性腫瘤。中醫認為宮頸癌屬崩漏、帶下、癥瘕等范疇，其主要病因是臟腑氣血失調、沖任受損，治療當以活血化瘀，補氣扶正為主[1]。黃芪、莪術配伍起到補氣化瘀的作用，這與宮頸癌患者機體的病證是相對應的。盡管目前黃芪、莪術的有效成分被不斷發現，但鮮有從整體角度研究黃芪-莪術的配伍機制。黃芪、莪術的多種有效成分及其整體協同的作用特點是治療宮頸癌的優勢所在。因此，本研究旨在通過生物信息學、GO聚類和k-核分解等方法識別黃芪-莪術誘導宮頸癌細胞凋亡的靶網絡，同時通過K-means聚類、分子對接和TOPSIS法確定潛在有效成分和關鍵靶點，通過CCK-8法、TUNEL染色、流式細胞術以及Western blot等方法探討其誘導凋亡的作用及整體配伍機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗細胞：宮頸癌SiHa細胞由浙江大學醫學院提供，培養于含10%胎牛血清的DMEM培養基中，置于37 ℃、含5%的CO2加濕恒溫培養箱中培養，并每周傳代2次。

1.1.2 藥物與試劑：黃芪、莪術中藥材購自杭州華東中藥飲片有限公司。DMEM培養液、胎牛血清和0.25%胰蛋白酶-EDTA購自美國Gibco公司。細胞培養瓶、6孔板、12孔板、96孔板和巴斯德吸管購自美國Corning公司。PBS購自杭州諾森德生物技術有限公司。CCK-8試劑盒、細胞周期與細胞凋亡檢測試劑盒、PMSF、BCA蛋白檢測試劑盒、RIPA裂解緩沖液和TBST購自合肥白鯊生物科技有限公司。TUNEL試劑盒、DAPI染色液購自上海碧云天生物技術有限公司。p53、β-catenin和GAPDH小鼠單克隆抗體購自武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 宮頸癌疾病背景網絡的構建：從Disgent（https://www.disgenet.org/）、OMIM（https://omim.org/）、KEGG（https://www.kegg.jp/）、TTD（http://db.idrblab.net/ttd/）和RGD（https://rgd.mcw.edu/）等數據庫收集宮頸癌相關蛋白。將這些蛋白映射到String（https://string-db.org/）數據庫構建宮頸癌疾病生物總網絡。通過Metascape（https://metascape.org/）對這些蛋白進行GO富集分析，每一條被富集的GO生物過程即為一個生物子網絡，這些生物子網絡之間相互連接構成了宮頸癌疾病背景網絡。所有網絡通過Cytoscape軟件進行可視化。

1.2.2 K-means聚類確定潛在關鍵靶點：通過對總網絡進行網絡分析，確定網絡中每一個節點的屬性。選取節點度和介數中心值兩個節點屬性進行K-means聚類分析。由于將宮頸癌相關蛋白分為潛在關鍵靶點和其他靶點兩類，因此設置中心點個數k=2；由于數據量相對較小，而迭代次數越多越好，因此設置最大迭代次數為100。通過SPSS22.0統計軟件進行分析，選取高節點度和高介數中心值的節點作為潛在關鍵靶點。

1.2.3 k-核分解確定靶網絡：將每一個生物子網絡進行k-核分解以獲取最大Ks核圖。Ks核可以定義為在圖G=(V, E)中，其中V={v1, v2, …, vN}是所有節點的集合，N是節點總數，E={e1, e2, …, eM}是所有邊的集合，M是邊的總數。若存在子圖Gk={(Vk, Ek),Vk?V, Ek?E}，對每個節點v∈Vk，v的節點度大于或等于k，則子圖Gk是圖G的Ks核。通過遞歸的方法去除所有節點度小于k的節點及其連邊，直到不能分解的最大Ks核子網絡，從而得到每個節點度都大于等于k的最大Ks核圖。最大Ks核圖中潛在關鍵靶點構成的網絡便是靶網絡。見圖1。

圖1 k-核分解示意圖

1.2.4 分子對接評估潛在關鍵靶點：通過TCMSP（https://tcmspw.com/）化合物數據庫收集黃芪、莪術的活性成分。將這些活性成分與靶網絡中的潛在關鍵靶點使用AutoDock Vina軟件進行分子對接。將這些潛在關鍵靶點與各自對應的已知抑制劑或激活劑進行分子對接，統計每一個靶點作用的廣泛性和有效性。廣泛性定義為能與該靶點結合的化合物數目，表示為對接得分小于-5 kcal/moL的化合物數。有效性定義為與該靶點結合能力比已知配體更好的化合物數目，表示與對接得分小于已知抑制劑或激活劑的化合物數。靶點有效性對應的化合物定義為該靶點的潛在有效成分。

1.2.5 TOPSIS法評估潛在關鍵靶點：TOPSIS法是多目標決策分析中一種常用的有效方法。由于潛在關鍵靶點的廣泛性和有效性都是正向的指標，所以通過公式進行標準化處理。隨后，確定每一個指標的最大值Z+和最小值Z-。再確定每一個評價對象與最大值的接近程度和最小值的接近程度最后，根據最終評價指標確定最佳潛在關鍵靶點。Ci越接近于1表明該靶點的廣泛性和有效性越好。

1.2.6 中藥水提液制備：根據中國藥典和臨床使用經驗，選用黃芪、莪術藥物用量比例為3:1。將藥物浸泡0.5 h，加10倍量的純水回流提取3次，每次0.5 h。進行旋轉蒸發濃縮藥液并定容至藥液濃度為1 000 mg/mL。1 000 r/min離心5 min后，0.22μm微孔濾膜濾過，4 ℃保存。

1.2.7 細胞活力測定：使用CCK-8法測定SiHa細胞的活力，將SiHa細胞以5×103個細胞/孔的密度接種到96孔板的對照和實驗組中。于24 h后，將實驗組的培養基更換為含有不同濃度中藥提取液的新鮮培養基，設置濃度梯度為6.25、12.5、25、50、100、200 mg/mL，對照組和空白組更換為無藥的新鮮培養基。分別干預24、48 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液孵育1.5 h，在450 nm波長處測定光密度（OD）值，并計算細胞活力及IC50。細胞活力（%）=（實驗組OD值-空白組OD值）/（對照組OD值-空白組OD值）×100%。每組至少設置6個復孔。

1.2.8 TUNEL染色：SiHa細胞以1×105個細胞/孔的密度接種在12孔板上。24 h后設置對照組與實驗組，對照組為無藥培養基，實驗組為濃度為IC50的黃芪-莪術水提液。分別孵育24 h和48 h后，根據說明使用TUNEL試劑盒。將細胞用PBS洗滌，加入蛋白酶K工作溶液，浸入封閉緩沖液中，固定、沖洗并用0.1% Triton X-100浸潤，然后對凋亡DNA片段進行FITC末端標記。細胞核用DAPI復染。在熒光顯微鏡下觀察FITC標記的TUNEL陽性細胞，在至少6個視野內對TUNEL陽性細胞進行拍照。采用ImageJ軟件計算細胞凋亡率，并進行統計分析。凋亡率（%）=凋亡細胞數/總細胞數×100%。

1.2.9 流式細胞術檢測細胞凋亡：SiHa細胞以5× 105個細胞/孔的密度接種在6孔板上。24 h后，設置對照組與實驗組，對照組為無藥培養基，實驗組為濃度為IC50的黃芪-莪術水提液。處理48 h后，用不含EDTA的胰酶消化后，用預冷的PBS洗滌細胞2次，4 ℃離心5 min收集細胞。加入100 μL 1×Binding Buffer重懸細胞，加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI Staining Solution。輕輕混勻后，避光、常溫反應10 min。最后，加入400 μL 1×Binding Buffer，混勻后上機檢測。

1.2.10 流式細胞術檢測細胞周期：SiHa細胞以1×105個細胞/孔的密度接種在6孔板上。處理48 h后，胰酶消化細胞，離心5 min沉淀細胞，用1 mL預冷的PBS洗細胞1次，再離心收集。細胞沉淀用1 mL預冷的70%乙醇混勻，4 ℃固定過夜。離心5 min沉淀細胞，加入0.5 mL碘化丙啶染色液，37 ℃避光孵育30 min后上機檢測。

1.2.11 Western blot分析：將SiHa細胞以5×105個細胞/孔的密度接種在6孔板中。處理48 h后，用預冷的PBS輕輕洗滌細胞兩次，分別加入PMSF、蛋白酶抑制劑和蛋白裂解液，冰上裂解15 min，4 ℃，離心30 min，提取總蛋白。采用BCA法進行蛋白定量，各泳道上30 μg蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳后轉移至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫（37 ℃）封閉1 h。隨后，加入一抗（1:1 000稀釋），4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，10 min/次，加入相應的二抗（1:5 000稀釋），室溫搖床孵育1 h，TBST洗膜3次。ECL增強化學發光試劑顯色成像。采用ImageJ軟件對條帶進行量化。

1.3 統計學處理方法 采用SPSS22.0統計軟件分析。計量資料以±s表示，2組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 宮頸癌疾病總網絡和潛在關鍵靶點 通過多個疾病數據庫刪除重復后共收集了979個宮頸癌相關蛋白，其中Disgent數據庫有964個，RGD數據庫22個，KEGG數據庫7個，TTD數據庫7個，OMIM數據庫1個。這些相關蛋白相互作用構成了宮頸癌疾病生物總網絡，見圖2A。刪除孤立節點和重復的邊后，網絡中共625個節點和3 553條邊。K-means聚類分析顯示，有73個宮頸癌相關蛋白具有高介數中心值和高節點度的特點，是潛在的關鍵靶點。所有節點的介數中心值與度的二分類見圖2B。

圖2 宮頸癌疾病生物總網絡和潛在關鍵靶點的二分類圖

2.2 宮頸癌背景網絡及GO聚類 將宮頸癌疾病生物總網絡進行GO聚類分析。取前20 個GO生物過程聚類重新構建網絡，獲得宮頸癌背景網絡圖，見圖3A。其中，前20個GO生物過程聚類的富集氣泡，見圖3B。富集分析結果顯示，排在第一位的GO生物過程是細胞死亡的正調控。在該GO聚類下，富集的子集分別是程序性細胞死亡的正調控、凋亡過程的正調控、凋亡信號通路的正調控、內源性凋亡信號通路的正調控。提示凋亡過程是宮頸癌疾病研究的一個重要過程。

圖3 宮頸癌背景網絡和GO生物過程聚類的富集分析

2.3 宮頸癌凋亡相關的靶網絡 凋亡相關的子網絡（即細胞死亡正調控的聚類）共富集了145個宮頸癌相關蛋白，在去除孤立節點后共107個節點和345條邊，見圖4A。對該網絡的k-核分解顯示，最大Ks為6，最大Ks核圖由26個節點和103條邊構成。在該最大Ks核圖中有14個潛在關鍵靶點通過41條邊緊密連接構成了凋亡相關靶網絡。

2.4 潛在關鍵靶點的綜合評估 通過成分數據庫共收集了87個黃芪活性成分和81個莪術活性成分。去除重復后，共166個成分與靶網絡中的14個潛在關鍵靶點進行分子對接。靶點廣泛性前三個靶點為SRC（154）、TP53（133）和SIRT1（123），靶點有效性前三個靶點為TP53（84）、CTNNB1（56）和CASP8（46）。通過廣泛性和有效性兩個指標對14個潛在關鍵靶點進行TOPSIS綜合評價，最高的前三個靶點分別為TP53（0.93）、CTNNB1（0.69）和CASP8（0.60），見表1。靶點有效性對應的化合物即為潛在有效成分，這些潛在有效成分與潛在關鍵靶點的作用關系見圖4B；提示64個黃芪潛在有效成分和44個莪術潛在有效成分協同作用于14個潛在關鍵靶點，同時絕大多數黃芪的成分（60個）作用于TP53，絕大多數莪術的成分（38個）作用于CTNNB1。

表1 靶網絡中潛在關鍵靶點分子對接與TOPSIS結果

圖4 凋亡相關子網絡的k-核分解和靶網絡潛在關鍵靶點與潛在有效成分的作用

2.5 黃芪-莪術水提液對SiHa細胞的細胞活力影響與對照組比，24 h和48 h的各濃度黃芪-莪術水提液的細胞存活率均顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖5A和圖5B。黃芪-莪術水提液在24 h和48 h的IC50分別為62.47 mg/mL和50.37 mg/mL，見圖5C。黃芪-莪術水提液對宮頸癌SiHa細胞生長具有顯著的抑制作用，并呈現一定的濃度依賴性。

圖5 黃芪-莪術（3:1）水提液對宮頸癌SiHa細胞活力的影響

2.6 黃芪-莪術水提液對SiHa細胞早期凋亡影響 SiHa細胞用濃度為50.37 mg/mL的黃芪-莪術（3:1）提取液分別處理24 h和48 h后，均可見明顯的TUNEL熒光，見圖6A和6B。與對照組比，24 h和48 h的細胞凋亡率明顯上升，差異有統計學意義（P＜0.05）；48 h與24 h相比，細胞凋亡率也明顯上升，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖6C。SiHa細胞用黃芪-莪術水提液處理后發生明顯凋亡，且48 h比24 h的凋亡更為明顯。

圖6 黃芪-莪術（3:1）水提液處理宮頸癌SiHa細胞24 h和48 h后的熒光染色結果（×100）

細胞凋亡的流式細胞術結果顯示，與對照組比，實驗組的早期凋亡率和總凋亡率明顯提高，差異具有統計學意義（P＜0.05），而晚期凋亡率差異無統計學意義（P＞0.05），見圖7。黃芪-莪術水提液主要誘導宮頸癌SiHa細胞發生早期凋亡。

圖7 黃芪-莪術（3:1）水提液對宮頸癌SiHa細胞細胞凋亡的影響

2.7 黃芪-莪術水提液誘導SiHa細胞G0/G1期阻滯 細胞周期的流式細胞術結果顯示，與對照組比，實驗組的G0/G1期細胞明顯增加，S期細胞明顯減少，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖8。黃芪-莪術水提液能誘導宮頸癌SiHa細胞在G0/G1期阻滯。

圖8 黃芪-莪術（3:1）水提液對宮頸癌SiHa細胞細胞周期的影響

2.8 黃芪-莪術水提液對p53 和β-catenin蛋白表達的影響 黃芪-莪術水提液處理48 h后，p53 和β-catenin的表達Western bolt條帶圖，見圖9A。與對照組比，實驗組的p53相對表達量明顯提高，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖9B。與對照組比，實驗組的β-catenin的表達水平變化不明顯，差異無統計學意義（P＞0.05），見圖9C。黃芪-莪術水提液能顯著提高宮頸癌SiHa細胞的p53表達水平。

圖9 黃芪-莪術水提液對p53和β-catenin蛋白表達的影響

3 討論

臨床上黃芪、莪術是一組常用藥對，從古至今廣泛應用于婦科癥瘕積聚等疾病。張錫純《醫學衷中參西錄·治女科方》中提到理沖湯，方中黃芪、黨參配三棱、莪術以消一切臟腑癥瘕、積聚[2]。國醫大師朱良春認為癌瘕積聚這類病癥應選益氣活血、化瘀生新之品，方能奏養正消積之功。他指出：“黃芪得莪術則使黃芪補而不滯，莪術得黃芪則助莪術破血化瘀之力以消癥瘕。兩藥相伍，使行中有補，補中有行，共奏補氣化瘀之功[3]。”黃芪作為一個補中益氣的常用中藥，含有多糖類、皂苷類、黃酮類以及氨基酸等多種有效成分，具有免疫刺激、抗腫瘤、抗病毒、抗炎和抗氧化等多種藥理活性[4-5]。莪術為破血行氣的代表中藥，含有揮發油、姜黃素類、多糖類及生物堿類等多種有效成分，具有抗腫瘤、抗血栓、抗氧化等多種藥理活性[6-7]。現代藥理學研究表明，黃芪作為天然的免疫調節劑，其多種有效成分通過增強機體的免疫機制而發揮抗腫瘤作用：黃芪多糖能夠提高免疫器官指數、促進免疫細胞的成熟、刺激細胞因子的釋放、影響免疫球蛋白的分泌和調節免疫信號的傳導，從而增強機體免疫功能[8]；黃芪甲苷IV能夠通過抑制調節性T細胞頻率以增強機體免疫反應，通過誘導細胞毒性T淋巴細胞激活以發揮體內抗癌活性[9]。莪術則作為抗

腫瘤常用中藥，其抗癌有效成分也不斷地被報道：姜黃素會擾亂線粒體膜電位的平衡而增強對Bcl-xL蛋白的抑制，同時上調死亡受體DR 4和DR 5的表達來促進癌細胞的凋亡[10]；β-欖香烯通過減弱癌細胞中Wnt/β-catenin信號通路而發揮治療作用[11]。因此，配伍使用黃芪、莪術防治宮頸癌的潛力巨大。

本研究通過生物信息學的手段收集了宮頸癌疾病相關蛋白并構建了對應的背景網絡。在對宮頸癌背景網絡進行GO富集分析后，本課題組發現排在第一位的GO生物過程是細胞死亡的正調控。在該GO聚類下，富集的子集分別是程序性細胞死亡的正調控、凋亡過程的正調控、凋亡信號通路的正調控、內源性凋亡信號通路的正調控。可見，凋亡是宮頸癌疾病研究的一個重要過程，這與本研究TUNEL染色和流式細胞凋亡的結果是一致的。隨后，繼續對該凋亡相關的子網絡進行深入分析，以獲取凋亡相關的靶網絡。然而，靶網絡的獲取過程很有可能是一個復雜網絡研究的過程，正如之前提到的，對于復雜疾病不能只專注于特定的疾病靶點，也無法關注所有的擾動。因此，更應該關注于復雜疾病網絡的核心，通過引入社會科學研究中常用的k-核分解這一方法，從而確定疾病網絡中的核心部分[12]。然而，考慮到生物網絡和社會網絡的差異性，如果直接進行k-核分解，可能許多重要的靶點被忽略，甚至獲得的核心網絡會毫無意義。生物網絡更傾向于不同生物過程的聚類，不同聚類之間連接的節點往往承載了許多的生物信息流。因此，在進行k-核分解之前通過構建背景網絡提前對整個疾病涉及的生物過程進行聚類，以防止確定的靶網絡單一化；通過K-means聚類分析確定潛在關鍵靶點，以防止確定的靶網絡忽略了重要的靶點。之后，通過分子對接和TOPSIS法綜合評估了凋亡相關靶網絡中的潛在關鍵靶點并確定了潛在的有效成分。發現64個黃芪潛在有效成分和44個莪術潛在有效成分協同作用于14個潛在關鍵靶點構成的靶網絡從而發揮誘導凋亡的作用。同時絕大多數黃芪的成分（60個）作用于TP53，絕大多數莪術的成分（38個）作用于CTNNB1。因此，最后通過Western blot檢測了TP53和CTNNB1兩個基因的蛋白表達水平。

TP53基因是一種抑癌基因，其編碼的蛋白p53介導的細胞信號轉導途徑在調節細胞正常生命活動中起著重要的作用[13]。當DNA受損時，p53會誘導p21的表達，從而導致細胞周期停滯在G1期，以允許DNA修復[14-15]。如果細胞不能修復DNA損傷，p53通過激活BAX、PUMA、Noxa和PERP等凋亡信號基因誘導細胞凋亡[16]。Western blot結果顯示，黃芪-莪術水提液能明顯提高p53蛋白的表達水平。同時，流式細胞周期結果也表明，黃芪-莪術處理后有更多的細胞阻滯在G0/G1期。因此，猜測作用于p53蛋白的60個黃芪潛在有效成分能協同拯救p53突變功能，促使p53介導的信號轉導恢復正常。CTNNB1基因編碼的蛋白β-catenin是一種黏著連接蛋白，通過調控細胞生長以及細胞間的黏附，對上皮細胞層的構建與維持起著重要作用[17]。細胞核中的β-catenin則是TCF/β-catenin轉錄的開關，調控著靶基因的轉錄[18]。凋亡抑制因子Survivin是Wnt/β-catenin信號下游靶基因的一員，能間接抑制效應caspase 3活性[19]，從而抑制細胞凋亡。然而，Western blot結果顯示，β-catenin的表達水平變化不明顯。猜測38個莪術潛在有效成分或許并不影響β-catenin的整體表達水平，但能通過某種方式抑制其在細胞核中的累積，發揮誘導凋亡的作用。

綜上所述，黃芪-莪術可能通過其多個有效成分協同調控以p53為主的靶網絡，使細胞周期阻滯在G0/G1期，從而發揮誘導宮頸癌細胞早期凋亡的作用。