STING-IRF3信號通路參與內質網應激介導的心肌自噬流損傷

李媛彬，陳 歆，邱愛珠，丘繼哲，袁湘蓮，陳 壯*

（湖南中醫藥高等專科學校醫學院，湖南 株洲 412012）

0 前言

心肌缺血再灌注（I/R）損傷引起的心肌細胞死亡是臨床再灌注治療中并發癥發生的主要危險因素[1]。因此，如何有效地減少心肌I/R中的細胞死亡是一個亟待解決的問題。內質網應激作為胞質信號網絡的整合者，與氧化應激、泛素蛋白酶體途徑和炎癥反應相關，參與心血管疾病的發生發展[2]。

研究表明內質網應激可引起再灌注后心肌的自噬，細胞自噬可降解內質網中無功能的錯誤折疊蛋白，以減輕內質網應激和未折疊蛋白反應[3]。內質網應激誘導的自噬可能與缺血的持續時間和嚴重程度有關。在輕度缺血時誘發細胞自噬導致ATP增加保證細胞的能量供應，而在重度缺血時伴發自噬流受損而造成細胞死亡。換句話說，適度的內質網應激誘導的自噬對心肌細胞有保護作用，但過度或強烈的內質網應激會阻礙自噬流引起心肌細胞死亡。因此，探討內質網應激與心臟自噬的潛在關系及機制具有重要意義。

干擾素基因刺激因子（STING）通常位于內質網膜上，可被病毒感染、內質網應激、游離細胞質DNA等因素激活[4]。STING參與了各種疾病中的炎癥和免疫反應。Petrasek J[5]等發現內質網應激可激活STING-IRF3信號通路，導致酒精性肝病肝細胞死亡。下調STING蛋白水平后，可以有效抑制IRF3磷酸化和肝臟損傷。最近的研究表明，STING參與內質網應激[6]介導的病理性心肌肥厚和纖維化。但STING-IRF3通路是否參與I/R后過度內質網應激對心肌自噬流的抑制作用尚未明確。

在本研究中，我們試圖研究干預內質網應激后對心肌I/R損傷后心肌自噬流及STING-IRF3信號通路的體內外影響，并進一步探討這些過程的潛在機制。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

野生型C57BL/6（10-12周齡）小鼠購于湖南斯萊克景達實驗動物公司；H9c2細胞購于上海Sciencell公司；STING、磷酸化TBK1（p-TBK1）、TBK1、磷酸化IRF3（p-IRF3）、IRF3和p62兔單克隆抗體以及羊抗兔抗體購自美國CST公司；Real time PCR試劑盒購于Promega公司；Rubicon引物由上海生工公司合成；4-PBA（CAS:1821-12-1）購自美國Sigma公司。

1.2 心肌I/R模型的建立

雄性野生型C57BL/6（10-12周齡）小鼠用2%異氟醚麻醉后，留置針氣管插管（經口），外置呼吸支持系統。在胸骨左緣第四肋間隙暴露心臟，用7-0縫線結扎左冠狀動脈左前降支30min。PowerLab系統顯示ST段抬高，作為結扎成功的標志。結扎30min后，解除結扎，心臟顏色恢復紅色時，關閉皮膚切口。所有小鼠均飼養在特定的無病原體動物房中，并按照實驗動物倫理委員會準則進行處理。

1.3 超聲心動圖評估心臟功能

小鼠麻醉后，使用經胸二維超聲心動圖，在胸骨旁左室長軸視圖上測量左室舒張末期內徑（LVIDd）和左室收縮末期內徑（LVISd），接著采用Vevo Analysis軟件（version3.0.0）分析左室縮短分數（LVFS）和左室射血分數（LVEF）的百分比。

1.4 染色質免疫沉淀（ChIP）和聚合酶鏈反應（PCR）

將按實驗方案處理后的H9c2細胞與1%甲醛室溫交聯20分鐘。接著把細胞與甘氨酸（最終濃度為0.125 mol/L）孵育5分鐘終止交聯。細胞DNA通過超聲波破碎。用IRF3抗體免疫沉淀蛋白-DNA復合物，然后用PCR檢測IRF3/Rubicon啟動子復合物。IgG作為陰性對照。Rubicon擴增引物為：F5'-GTCCCCTGACATATCGTAGACT-3'，R5'-TGAAGAAGGCATTGGGTGGA-3'。

1.5 細胞培養及H/R模型

H9c2細胞在含10%胎牛血清的DMEM培養24-36小時，轉移至三氣培養箱（含5%二氧化碳和95%N2）在37°C培養6h后,在含5%CO2和95%O2，10%胎牛血清的DMEM條件下復氧18h，復制缺氧/復氧（H/R）模型 。

1.6 免疫印跡

心肌組織或細胞在含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液中勻漿，然后蛋白質樣品通過10%SDS -聚丙烯酰胺凝膠（PAGE）進行分離，轉移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上（美國Millipore）。用5%脫脂奶粉封閉，與STING、p-IRF3、IRF3（1:3,000）4℃孵育過夜，用含0.1%吐溫-20的TBST沖洗膜3次（每次10分鐘）后，再與HRP交聯的二抗室溫孵育2h。TBST沖洗膜3次后，使用ECL（Thermo Fisher Scientific,32106）觀察免疫反應蛋白條帶，并用Alpha Imager 2200進行定量。

1.7 統計學處理

數據均采用均數±標準差表示，用SPSS 22.0進行統計學分析，對多組采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 抑制內質網應激減輕心肌I/R損傷

與假手術組小鼠相比，I/R組小鼠的血清肌酸激酶（CK）水平明顯升高；與I/R組小鼠相比，4-PBA預處理組小鼠血清CK水平顯著降低，見圖1。此外，超聲心動圖檢查顯示，與假手術組小鼠相比，I/R組小鼠的LVFS和LVEF值顯著降低；而4-PBA處理改善了小鼠I/R后的心功能，心室FS、EF均提高，見圖1。這些結果表明，抑制內質網應激可能在心肌I/R損傷后心臟功能的維持中發揮了重要作用。

圖1 心肌組織中p62、Rubicon表達水平

表1 各組小鼠血清 CK-MB含量和心功能指標變化

2.2 抑制內質網應激增加心肌I/R損傷后自噬流

進一步探討抑制內質網應激改善心肌功能的可能機制是否與心肌I/R損傷后細胞自噬增加有關。如圖1所示，I/R組小鼠心肌組織中p62和Rubicon表達水平升高，用4-PBA預處理后，p62和Rubicon的表達明顯發生逆轉。

2.3 抑制內質網應激下調心肌I/R損傷后STING-IRF3通路介導的自噬負調控分子的表達

接著檢測內質網應激是否為STING-IRF3信號通路激活的潛在機制。結果顯示，STING、p-TBK1和p-IRF3的蛋白水平在再灌注12h后顯著升高，而與I/R組相比，4-PBA處理降低了STING、p-TBK1和p-IRF3的蛋白水平，見圖2（P287）。我們的研究結果表明，抑制內質網應激下調了I/R誘導的心肌組織中STING-IRF3信號的激活。

圖2 心肌組織中STING、p-TBK1、p-IRF3表達水平

ChIP-PCR結果進一步證實，H/R處理增加了IRF3對Rubicon啟動子的結合，而4-PBA則降低了這種相互作用，見圖3。總的來說，這些結果表明STING-IRF3信號通路通過與Rubicon結合阻斷自噬流。

圖3 ChIP-PCR檢測H9c2細胞中IRF3與Rubicon啟動子的結合Ctrl：正常組，H/R：缺氧復氧組

3 討論

在本研究中，我們證實了內質網應激誘導的STINGIRF3信號通路參與了心肌I/R損傷發病過程的新作用。我們觀察到小鼠心肌再灌注損傷后STING、p-TBK1和p-IRF3的表達顯著升高。內質網應激抑制劑4-PBA能夠促進心肌自噬，降低血清CK-MB水平，改善心肌收縮功能。此外，4-PBA預處理可以抑制心肌I/R后的STING-IRF3信號活化，從而減輕心肌損傷。體外分析進一步證實了STING-IRF3信號通路和自噬分子之間的相互作用。這些結果提示，內質網應激與心肌I/R中自噬障礙之間存在潛在的相關性，但具體的機制有待進一步探討。

眾所周知，自噬有利于心肌細胞存活，自噬的激活可能是內質網應激活化后在再灌注損傷發展過程中的相關代償機制。內質網應激激活后，自噬活性增加，參與折疊或錯誤折疊蛋白的降解和去除。然而，I/R損傷時自噬小體清除障礙，導致細胞死亡。因此，參與自噬流受損相關的內質網過度應激可能是導致心肌I/R損傷的機制之一。那么內質網應激是如何調節自噬導致細胞死亡的機制尚不清楚。

Rubicon是自噬小體/核內體成熟的負調控因子[7]。Rubicon缺乏可增強心臟自噬，保護小鼠免受LPS誘導的損傷[8]。我們的結果證實I/R損傷上調心肌組織中STINGIRF3信號通路，STING-IRF3通路是否直接參與心肌I/R誘導的自噬流障礙還不得而知。在進一步實驗中，我們發現內質網應激介導的STING-IRF3信號通路通過IRF3結合Rubicon，促進Rubicon的表達，從而抑制心肌細胞自噬流。這些數據再次表明，自噬受損與心肌I/R損傷中的STING-IRF3信號通路活化相關。

近來研究發現，miR-24-3p通過調控STING的表達，在肝臟I/R[9]過程中抑制炎癥，緩解細胞凋亡。在小膠質細胞中，HDAC3-p65-cGAS-sting通路參與了I/R誘導的神經炎癥，體內實驗表明，缺失小膠質細胞cGAS或HDAC3可減輕I/R誘導的腦損傷和神經炎癥[10]。與上述結果一致，我們的數據表明，內質網應激是激活STING的上游因子，4-PBA通過調節內質網應激誘導的STING- IRF3信號通路，在I/R過程中發揮心臟保護作用。因此，這些發現進一步證實了干預這一通路是防治心肌細胞死亡以及再灌注后心律失常和心力衰竭并發癥的潛在靶點。

綜上所述，我們明確了STING-IRF3是心肌I/R損傷病理過程中的關鍵信號通路，其通過與Rubicon結合抑制心肌自噬流；4-PBA通過降低STING-IRF3活化和促進自噬流在I/R期間發揮心臟保護作用。