miR-7-5p靶向抑制REGγ對三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231遷移及侵襲能力的調控作用

姚旭楓，蒲映宏，楊君毅，羅鑫榮，王小毅

(重慶醫科大學附屬第一醫院內分泌乳腺外科，重慶 400016)

乳腺癌目前已成為全球發病率及死亡率最高的女性惡性腫瘤，三陰性乳腺癌是其中一種類型，特征為腫瘤細胞不表達雌激素受體、孕激素受體和人表皮生長因襲受體2，由于缺乏相對特異的治療措施，預后相對較差[1]。腫瘤轉移是惡性腫瘤最重要的特征之一，嚴重影響患者的生存時間及生活質量[2]。因此，尋找能夠負向調控三陰性乳腺癌細胞侵襲轉移能力的靶向具有重要意義。本課題組前期研究[3]發現，蛋白酶體激活因子3(REGγ)在乳腺癌中表達顯著上升，與淋巴結轉移直接相關，提示REGγ在乳腺癌中發揮促進腫瘤的作用。因此，如何抑制REGγ的表達發揮抑癌作用值得進一步研究。微小RNA(microRNA)是一類高度保守的小分子RNA，能夠轉錄后調控基因的表達受到關注[4]。通過生物信息軟件查詢，REGγ為miR-7-5p下游潛在靶基因。多項研究[5-7]表明，miR-7-5p可通過調控PI3K/Akt、FAK、KLF4等基因抑制腫瘤細胞的增生、上皮間質轉化、轉移等。本課題組前期研究[8]還發現，miR-7-5p能夠通過靶向調控REGγ的表達，進而抑制MDA-MB-231細胞的增殖，但是否參與調控三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231的遷移和侵襲尚不明確。本研究以MDA-MB-231細胞為研究對象，旨在探討miR-7-5p靶向抑制REGγ對三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231遷移和侵襲能力的調控作用。

1 材料和方法

1.1 材料

MDA-MB-231細胞株(中科院上海細胞資源中心)，1640培養液(Gibco公司，c11875500bt)，胎牛血清(Gibco公司，10099141c)，胰蛋白酶(Gibco公司，25200072)，雙熒光素酶報告基因試驗系統(Promega公司，E1910)，miRNA反轉錄試劑盒(銳博公司，Lot2121)，miRNA qRT-PCR引物(銳博公司，MQPS0002204)，qRT-PCR試劑盒(Invitrogen，4385617)，Transwell小室(Millipore公司，MCMP24H48)，Matrigel膠(Millipore公司，E1270)，TRIzol(Invitrogen公司，15596026)，脂質體2000(Invitrogen公司，11668019)

1.2 方法

1.2.1 MDA-MB-231細胞培養及分組 MDA-MB-231細胞用含10%胎牛血清的1640培養液進行貼壁培養，培養條件：37 ℃，5% CO2培養箱；當細胞生長至鋪滿培養板底部80%～90%時，使用0.125%胰蛋白酶進行消化和傳代。根據實驗需求，將細胞接種至6孔板并分為陰性對照組，REGγ敲減組，miR-7-5p過表達組，REGγ和miR-7-5p同時過表達組。一般為2×105/mL，當細胞密度為70%～80%時進行RNA或蛋白提取。

1.2.2 劃痕愈合實驗 MDA-MB-231細胞接種在6孔板中，生長至基本鋪滿6孔板，使用20 μL移液頭以相同的力度及角度在培養孔中央作一縱行劃痕，用PBS洗掉多余的細胞，并進行拍照記錄，劃痕寬度記為L0，24 h后進行拍照，劃痕寬度記為L1。按照公式(L0-L1)/L0計算劃痕愈合程度。

1.2.3 Transwell實驗 侵襲實驗需提前鋪Matrigel膠，遷移實驗則不需要；將Matrigel膠與無血清1640培養液按照1∶8比例稀釋，每個小室加入50 μL，37 ℃至膠凝固；使用時鋪膠的小室加入無血清培養基，然后輕輕吸出所有的液體；經過處理的MDA-MB-231細胞，計數2×105/mL，用無血清1640重懸后接種100 μL在涂有Matrigel膠的Transwell上層小室內，小室的下層加入600 μL含有10%胎牛血清的1640培養，24 h后，用磷酸鹽緩沖液漂洗小室3次，棉簽擦拭小室上層的細胞和Matrigel膠，4%多聚甲醛固定過夜，0.1%結晶紫染色，室溫放置，將膜洗凈晾干，固定于載玻片上，顯微鏡照相記數。

1.2.4 qRT-PCR實驗 收集經過處理的MDA-MB-231細胞，采用TRIzol法提取樣本的總RNA并ND2000測取濃度，使用逆轉錄試劑盒合成cDNA，使用銳博miRNA逆轉錄試劑盒合成cDNA，以cDNA為模板進行qRT-PCR擴增。miR-7-5p以U6為內參，REGγ以β-actin為內參。采用2-△△Ct法計算相對表達量，實驗重復3次。

1.2.5 雙熒光素酶報告基因實驗 使用課題組前期構建的攜帶REGγ3端非編碼區質粒，野生型pMIR-REPORT-REGγ-3′UTR-WT和突變型pMIR-REPORT-REGγ-3′UTR-Mut，在MDA-MB-231細胞中使用脂質體2000共轉染攜帶REGγ3端非編碼區質粒、miR-7-5p或陰性對照，海腎熒光pRL-TK質粒。轉染后48 h，使用雙熒光素酶報告基因實驗系統檢測熒光值。

1.3 統計學分析

采用SPSS19.0軟件對數據進行分析與處理，組間比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 敲減REGγ對MDA-MB-231細胞侵襲能力的抑制作用

采用課題組前期構建的陰性對照細胞株及REGγ敲減細胞株，通過Transwell檢測MDA-MB-231細胞的侵襲能力，結果顯示，與陰性對照組相比，REGγ敲減組的侵襲細胞數目減少(P<0.05)。見圖1。

2.2 miR-7-5p可特異結合REGγ的3端非翻譯區

采用課題組前期構建的野生型pMIR-REPORT-REGγ-3′UTR-WT (REGγ3′UTR)和突變型pMIR-REPORT-REGγ-3′UTR-Mut (REGγ3′UTRm)質粒，雙熒光素酶報告基因實驗檢查熒光值，結果顯示，在MDA-MB-231細胞中，與突變型質粒相比，miR-7-5p可抑制野生型質粒組的相對熒光值(P<0.05)。見圖2。

2.3 過表達miR-7-5p對MDA-MB-231細胞遷移和侵襲的調控作用

Transwell實驗結果顯示，與陰性對照組相比，miR-7-5p過表達組劃痕愈合明顯減緩(P<0.05)，侵襲細胞數目明顯減少(P<0.05)。見圖3。

2.4 共表達miR-7-5p和REGγ對MDA-MB-231細胞侵襲的調控作用

Transwell實驗結果顯示，與單獨過表達miR-7-5p相比，同時過表達miR-7-5p和REGγ可使侵襲細胞數目增多(P<0.05)，但未超過陰性對照組(P<0.05)。

3 討論

侵襲和轉移是惡性腫瘤最重要的生物學特征，具體調控機制尚不明確，嚴重影響患者的生存時間及生活質量[2]。三陰性乳腺癌是乳腺癌的其中一個亞型，占15%～20%，因缺乏相對特異的治療措施，治療效果欠佳[9]。本課題組前期研究發現，miR-7-5p可通過靶向調控REGγ抑制三陰性乳腺癌細胞的增殖能力。為明確miR-7-5p在三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231遷移和侵襲中的調控作用，本研究通過敲減REGγ，過表達miR-7-5p，同時過表達REGγ和miR-7-5p，發現過表達miR-7-5p可抑制MDA-MB-231細胞的遷移和侵襲能力，過表達REGγ可削弱miR-7-5p的抑癌作用，證實miR-7-5p可通過靶向調控REGγ的表達，從而抑制MDA-MB-231細胞的遷移和侵襲能力，發揮抑癌作用。

REGγ又名PSME3，是一類通過水解下游目標蛋白發揮癌基因角色的蛋白酶，具體機制不明確，可能是通過激活20s蛋白酶體或非泛素化依賴的途徑發揮蛋白降解功能[10-12]。課題組前期研究[3，13]顯示，REGγ在乳腺癌中表達上升，與淋巴結轉移密切相關，敲減REGγ的表達能夠抑制乳腺癌細胞的遷移和侵襲，提示REGγ與乳腺癌的侵襲轉移有密切關系。本研究顯示，無論是直接敲減REGγ，還是通過miR-7-5p的轉錄后抑制，均可達到抑制三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231的侵襲能力，提示靶向抑制REGγ可發揮抑制三陰性乳腺癌細胞的侵襲轉移的作用，但REGγ如何發揮抑制作用目前尚無明確的機制。腫瘤侵襲轉移于Wnt、JAK/STAT等信號通路異常活化關系密切，REGγ是否可能通過水解信號通路抑制因子發揮促進腫瘤的作用值得進一步研究。

miRNA是一類高度保守的RNA，依靠調控下游基因的不同發揮不同的生物學功能。研究顯示，miR-7-5p在多種惡性腫瘤中表達下調，可通過負向調控PI3K/Akt、FAK和KLF4等下游靶標發揮抑制腫瘤侵襲轉移的特性[5-7]。但是，miRNA也表現出靶點不特異的缺點。本研究顯示，過表達miR-7-5p可靶向結合REGγ的3斷非編碼區，從而抑制三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231的遷移和侵襲，但是這種抑制作用無法被過表達下游基因REGγ完全逆轉。miR-7-5p可靶向結合REGγ并抑制REGγ的表達，可以作為一個基因精準調節的工具；另外，miR-7-5p還同時調控其它下游基因發揮抑癌作用。因此，miRNA是通過調控下游基因的表達發揮特定功能。

綜上所述，miR-7-5p通過靶向抑制REGγ的表達，通過負向調控三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231遷移和侵襲，進而發揮抑癌作用。