小鼠腸道乳酸菌定植機制與影響分析

◎ 張艷艷

（漢臣氏（沈陽）兒童制品有限公司，遼寧 沈陽 110000）

乳酸菌是基于發酵碳水化合物生成眾多乳酸細菌的集合體，其在益生菌家族當中，屬于十分關鍵的菌株之一，其在參與改善腸道菌群平衡狀態、參與免疫應答以及抑制腸道病原菌生長繁殖等一系列益生功能方面，有著不容忽視的作用[1-2]。從人體內乳酸菌數量和種類最為豐富的部位——消化道來看，乳酸菌種類與數量也由于消化道部位的區別，而有著比較明顯的差異。其中，胃中的乳酸菌數量相對最少，這是因為胃酸可以將一些乳酸菌殺死。但在盲腸和結腸當中乳酸菌數量相對較多，介于106～1010CFU·g-1[3-5]。

在本試驗當中，運用平板培養的方式，分離出傳統發酵食品當中所包含的乳酸菌，篩選出不同類型的乳桿菌各1株，將其制作成為混合菌，完成液灌胃小鼠工作[6]。借助于實時熒光定量PCR技術，進一步檢測灌胃混合菌液之前、之后小鼠糞便當中6種不同乳桿菌數量所發生的具體變化，由此探索菌株具有的定植特性，掌握乳桿菌在小鼠腸道當中的定植能力狀況。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

東北酸菜、酸奶，均來自市面銷售；陳醋醋醅，源自陳醋醋酸發酵時期；發酵面團，源自農家自制的老面團。

1.2 培養基與試劑

MRS培養基：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母粉5 g，葡萄糖20 g，K2HPO42 g，檸檬酸二銨2 g，乙酸鈉5 g，吐溫-80 1 mL，MgSO4·7H2O 0.58 g，MnSO4·4H2O 0.25 g，蒸餾水1 000 mL，pH 6.2～6.4；Fast DNA Spin Kit for Soil試劑盒，由北京聯立信生物科技有限公司所生產；Taq DNA酶、dNTPs、10×PCR buffer，由天根生化科技有限公司所生產；SYBR Green Supermix，BIORAD；瓊脂糖回收試劑盒，由天根生化科技有限公司所生產；其他相關的化學試劑，由國藥集團化學試劑有限公司所生產。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌分離和鑒定工作

將不同類型的發酵食品樣品相繼在生理鹽水當中進行振蕩處理，對上述樣品溶液進行10倍梯度稀釋，選擇相符的稀釋度，開展MRS平板涂布工作，在37 ℃恒溫培養箱當中，培養時間持續48 h。在看到長出單菌落的情況下，挑選出不同形態與大小的菌落進行劃線純化處理。在完成3次分離純化工作之后，針對菌株進行革蘭氏染色鏡檢，并且最終確定菌株所處的形態。將完成鏡檢之后的菌株接種在MRS液體培養基當中進行傳代培養，并將其保存在MRS斜面培養基當中，在4 ℃冰箱環境中進行保藏與備用。

1.3.2 動物實驗方案

將用于實驗研究的16只小鼠隨機分成兩組，一組作為實驗組，而另外一組則作為對照組。兩組小鼠在經過1周時間的適應期之后，進入干預期。在干預期內，實驗組每天灌胃總量應達到6×108CFU的混合菌粉，灌胃時間為2周。對照組小鼠灌胃相同總量的脫脂乳。收集兩組不同的小鼠在灌胃之前，以及灌胃之后4 d、6 d、8 d、10 d、12 d和14 d的糞便樣品，在-80 ℃環境下進行保存和備用。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌的分離鑒定結果及試驗菌株

從不同發酵食品當中，經過分離可以得到不同類型的乳酸菌，針對分離得到的菌株予以16S rDNA序列分析以及BLAST比對工作，進而明確菌株的相應種屬，結果見表1。從表1可以了解到，從市面銷售的酸奶當中分離得到鼠李糖乳桿菌與保加利亞乳桿菌，從陳醋醋醅當中分離得到干酪乳桿菌和瑞士乳桿菌，從東北酸菜中分離得到植物乳桿菌，從老面團當中分離得到酵乳桿菌。從分離得到的6種不同菌株當中，篩選出6株乳桿菌（植物乳桿菌H7、干酪乳桿菌C6、鼠李糖乳桿菌Y4、發酵乳桿菌Z1、瑞士乳桿菌C36和保加利亞乳桿菌Y3）開展后續的動物實驗，進而測定其在小鼠腸道當中所具有的定植能力。

表1 不同類型發酵食品中分離的具體結果表

2.2 乳桿菌在小鼠腸道的定植能力

采集實驗組小鼠在灌胃混合菌液之前與之后的糞便樣品。借助于Fast DNA Spin Kit for Soil試劑盒，提取糞便樣品的相應基因組DNA。將以上基因組DNA作為模板，運用6對乳桿菌特異性引物，開展熒光定量PCR擴增工作，進而獲得Ct值。將不同乳桿菌標準曲線換算成為拷貝數，由此得到每克糞便樣品當中所包含的6種乳桿菌量。對比接受乳桿菌處理之前與之后的小鼠糞便當中以上乳桿菌實際含量，在后者超出前者的情況下，則代表喂食的乳桿菌在小鼠腸道內部定植，可持續觀察并對比每株菌具體的定植量。依次測定處在適應期最后1 d時間，以及完成灌胃4 d、6 d、8 d、10 d、12 d和14 d時間的小鼠糞便樣品當中所包含的6種乳桿菌量，結果見表2。

表2 不同小鼠糞便樣品中6種不同乳桿菌的含量表

由表2當中能夠了解到，在灌胃完成后的兩周時間內，小鼠糞便當中植物乳桿菌及干酪乳桿菌的量明顯超出了灌胃之前的含量，可見植物乳桿菌H7與干酪乳桿菌C6均已超出腸道中該種菌原始狀態一個數量級的水平，進而實現至少定植14 d。而對于瑞士乳桿菌C36、鼠李糖乳桿菌Y4以及發酵乳桿菌Z1來講，則并未在小鼠腸道內部定植。保加利亞乳桿菌Y3通過相對較少的定植量，實現了定植8 d。

借助于特異性PCR引物開展熒光定量PCR，能夠有效定量糞便樣品當中包含的不同乳桿菌。經過一系列的檢驗，此類引物有著良好的特異性，可以抵抗同屬不同種乳桿菌帶來的干擾。6種乳桿菌標準曲線有著較高的相關性，可見PCR所處的條件十分適宜，引物特異性相對良好，這一方法可以應用在糞便樣品乳桿菌的有關定量檢測工作方面。將小鼠作為實驗動物模型，檢測6株乳桿菌在腸道當中具有的定植能力。從結果得知，不同菌株具有的定植能力差異比較明顯，而定植能力大小在不同種間是否也具有差異，仍需要予以深入研究。

3 結論

現階段，針對乳酸菌在腸道定植的研究已經有了相關成果，但定植機制并未進行深入研究。雖然當前已有體外黏附模型便于開展乳酸菌在腸道定植機制研究工作，但其體外模型無法體現出乳酸菌在腸道環境內部最為精確的定植效果。因此，建立出科學有效的定植能力的評估方法不容忽視。與此同時，復雜腸道環境中不同因素的干擾為乳酸菌在示蹤和定量方面帶來不容忽視的挑戰。今后研究的重點，應針對此類環境干擾因素，開發出不同的示蹤技術、定量方法以及借助于和其他組學結合予以相關的研究，力求追蹤乳酸菌在復雜腸道環境下的具體定植位點，外加準確判斷出定植時間與數量。此外還應和其他學科密切結合，如運用新型納米材料、軟件分析等有關的技術，對乳酸菌腸道定植機理開展更加精確與深層次的研究工作。未來還應探索影響菌株定植能力的一系列因素，以期借助于體外篩選的方式，獲得有著良好定植能力的眾多潛力益生菌。