基于HPLC-MS/MS的內(nèi)標(biāo)法測定靈芝孢子粉中黃曲霉毒素B1含量的不確定度評定

◎ 陳 云，吳妙姍，崔 平

（安徽工業(yè)大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院，安徽 馬鞍山 243000）

靈芝孢子粉是靈芝生長成熟后從菌蓋彈射出的含有豐富的蛋白質(zhì)、多糖、三萜、脂肪酸等成分的孢子，具有抗腫瘤細胞、降低血糖、抗氧化等功效[1]。長三角地區(qū)的地理環(huán)境和氣候易使靈芝孢子粉在生長和儲存過程中發(fā)生霉變，產(chǎn)生黃曲霉毒素。黃曲霉毒素主要有黃曲霉、寄生曲霉、集峰曲霉和偽溜曲霉4種曲霉菌產(chǎn)生的次生代謝物。現(xiàn)階段可以分離鑒定出18種包括B1、B2、M1、M2、G1、G2、Q、P1、H1和GM等[2]，而其中黃曲霉B1是劇毒且最危險的致肝癌物質(zhì)，常在糧食谷物、油、牛奶、飼料等中檢出[3]。目前薄層色譜法[4]、酶聯(lián)免疫吸附法[5]、高效液相法[6]、液相質(zhì)譜聯(lián)用法[7]及氣相質(zhì)譜聯(lián)用法可作為黃曲霉毒素的檢測手段。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

靈芝孢子粉（安徽霍山）；黃曲霉毒素B1（AFB1）（2.01±0.05） ng·mL-1；黃曲霉毒素B1同位素內(nèi)標(biāo)（13C17-AFB1）（0.501 ng·mL-1），甲醇、乙腈和甲酸銨（色譜純）。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 6460型串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀（美國安捷倫）；N-EVAPTM111型氮吹儀（美國Organomation）；CQ-300B-S超聲清洗機（上海躍進器械）；HC-3018R高速離心機（安徽中科）；MS3 digitial渦旋混勻器（德國IKA）；AL204型電子天平（賽多利斯）。

1.3 實驗方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)系列溶液配制

AFB1標(biāo)準(zhǔn)品取0.2 mL至10 mL容量瓶中用乙腈定容，配制標(biāo)準(zhǔn)工作液（100 ng·mL-1），然后精確量取50 μL、100 μL、200 μL、300 μL、400 μL、600 μL至10 mL容量瓶中，加入100 μL同位素內(nèi)標(biāo)液，用初始流動相定容至刻度，配制濃度為0.5 ng·mL-1、1.0 ng·mL-1、2.0 ng·mL-1、3.0 ng·mL-1、4.0 ng·mL-1、6.0 ng·mL-1，內(nèi)標(biāo)濃度均為5.0 ng·mL-1的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.2 待測樣品制備

在50 mL離心管中稱樣5 g，加入0.1 mL同位素內(nèi)標(biāo)液混勻，加入20.0 mL 90%乙腈溶液，超聲5 min，5 000 r·min-1轉(zhuǎn)速離心3 min，取4.0 mL上液，加入蒸餾水20 mL，過免疫親和柱凈化，乙腈洗脫，收集凈化液45 ℃氮吹近干，用流動相定容至1.0 mL，過0.22 μm濾膜上機待測。

1.3.3 數(shù)學(xué)模型確定

根據(jù)同位素內(nèi)標(biāo)法曲線推算AFB1濃度，計算如下式：

式中：X為試樣中AFB1的含量，μg·kg-1；ρ為樣品溶液在同位素內(nèi)標(biāo)曲線中濃度，ng·mL-1；V1為試樣提取體積，mL；V3為凈化后最終體積，mL；1 000為換算系數(shù)；V2為凈化時取樣體積，mL；m為稱樣量，g。

1.3.4 儀器條件

（1）液相色譜條件。色譜柱為Aglient SB-C18（50 mm×4.6 mm，1.8 μm）；流動相A：5 mmol·L-1甲酸銨水溶液，流動相B：乙腈-甲醇溶液（1∶1），流動相比例為40∶60；流速：0.25 mL·min-1；柱溫：35 ℃。

（2）質(zhì)譜條件。方式：多反應(yīng)檢測MRM；離子源：電噴霧ESI；干燥器溫度：300 ℃；干燥氣流量：11 L·min-1；霧化器壓力：15 psi；掃描方式：正離子，各目標(biāo)物參數(shù)見表1。

表1 質(zhì)譜離子參數(shù)表

2 結(jié)果與分析

以AFB1與13C17-AFB1色譜峰面積比為縱坐標(biāo)，AFB1與13C17-AFB1質(zhì)量濃度比為橫坐標(biāo)進行擬合，擬合后回歸方程為Y=1.967 766X+0.002 994，相關(guān)系數(shù)R2為0.995 3。分析了7份靈芝孢子粉陽性樣品，可計算出7份樣品中AFB1含量分別為2.83 μg·kg-1、2.82 μg·kg-1、2.86 μg·kg-1、2.84 μg·kg-1、2.81 μg·kg-1、2.83 μg·kg-1及2.84 μg·kg-1，均值為2.83 μg·kg-1，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.56%。

3 不確定度來源確定

根據(jù)試驗的數(shù)學(xué)模型分析，AFB1的同位素內(nèi)標(biāo)法測量結(jié)果產(chǎn)生的不確定度主要由稱取樣品質(zhì)量、樣品處理過程、標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度、測量重復(fù)性、工作曲線和分析儀器本身6方面組成。

3.1 稱取樣品質(zhì)量產(chǎn)生的不確定度分量

用電子天平稱量樣品，稱樣量引入的不確定度m=5.000 0 g，天平誤差±0.000 1 g，則

3.2 樣品處理引入的不確定度

樣品加入內(nèi)標(biāo)物0.1 mL，定容總體積為20 mL，吸取4 mL上清液凈化后定容至1 mL。根據(jù)《實驗室玻璃儀器 單標(biāo)線吸量管》（GB/T 12808—2015）和《實驗室玻璃儀器 分度吸量管》（GB/T 12807—1991）規(guī)定：過程中使用20 mL和1 mL單標(biāo)吸量管，1 mL和5 mL分度吸量管的允許差分別為±0.030 mL、±0.007 mL、±0.008 mL和±0.025 mL，其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為：

則樣品處理過程中引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度可合成為：

3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的不確定度

3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度

使用AFB1濃度是（2.01±0.05） ng·mL-1，提供的不確定度包含因子則相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

3.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的不確定度

用1 mL分度吸量管移取0.5 mL的AFB1標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)于10 mL容量瓶（A級）中，得到100 ng·mL-1的AFB1標(biāo)準(zhǔn)工作液。設(shè)所有操作過程中溫度一致，體積微量變化不計入，1.0 mL分度吸量管urel(V11)=0.004 6，10 mL容量瓶在《實驗室玻璃儀器 單標(biāo)線容量瓶》（GB/T 12806—2011）中允許差為±0.020 mL，按三角分布處理：

稀釋重復(fù)性容量瓶為0.10 mL，按均勻分布計算：

相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度合成為：

3.3.3 分取標(biāo)準(zhǔn)溶液體積不確定度。

配制系列標(biāo)準(zhǔn)溶液時用1 mL A級分度吸量管分取0.05 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.30 mL、0.40 mL、0.60 mL AFB1儲備液于10 mL A級容量瓶，再各自加入0.1 mL內(nèi)標(biāo)液，定容。其中1 mL的A級分度吸量管使用12次，10 mL A級容量瓶使用6次。因此，系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的不確定度為：

相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

3.4 測量重復(fù)性的不確定度

同一條件下，對同一樣品重復(fù)測定7次，結(jié)果如表3。

表2 測量結(jié)果表

表3 測量結(jié)果表

根據(jù)分析結(jié)果，可計算得樣品AFB1濃度和數(shù)據(jù)列的標(biāo)準(zhǔn)差s：

則標(biāo)準(zhǔn)和相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度計算為：

3.5 工作曲線的變動性分量

擬合后的AFB1標(biāo)準(zhǔn)溶液數(shù)據(jù)結(jié)果表4所示。

線性方程為：Y=1.967 766X+0.002 994，擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線殘余標(biāo)準(zhǔn)偏差：

按照下式計算工作曲線的不確定度：

每份樣品和工作曲線溶液各測量1次。

樣品濃度為2.83 ng·mL-1，內(nèi)標(biāo)物濃度為5.0 ng·mL-1，故相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

3.6 分析儀器的不確定度

操作過程中已包括樣品重復(fù)測定和標(biāo)曲的線性擬合，故檢測分析儀器不再計算不確定度。

3.7 合成不確定度

合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

則標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

4 擴展不確定度評定

樣品中AFB1的含量為2.83 μg·kg-1，在置信水平95%時，取包含因子k=2，U=0.13×2=0.26 μg·kg-1。靈芝孢子粉中AFB1的含量結(jié)果表示為（2.83±0.26）μg·kg-1，k=2。

5 結(jié)論

本實驗建立了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜內(nèi)標(biāo)法測定靈芝孢子粉中黃曲霉毒素B1含量的檢測方法，從稱取樣品質(zhì)量、樣品處理過程、標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度、測量重復(fù)性、工作曲線及分析儀器本身6方面不確定度的評定發(fā)現(xiàn)影響結(jié)果的主要因素為標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制和標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合，因此可通過選擇更加精密的計量器具，增加標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度點及提升操作人員的能力水平等方法來降低不確定度，提高結(jié)果的準(zhǔn)確性。