水產(chǎn)品中生物活性肽的研究進(jìn)展

◎ 張龍翼，張鵬程，陳秋月，彭海川，錢 琴，王林果，賈濺琳，張 崟

（成都大學(xué)，四川 成都 610106）

生物活性肽的分子結(jié)構(gòu)介于氨基酸和蛋白質(zhì)之間，是一種蛋白質(zhì)片段。一旦從原始蛋白質(zhì)中釋放出來，就會表現(xiàn)出不同的功能[1]。肽表現(xiàn)出的不同生物活性取決于它們的結(jié)構(gòu)、組成和序列[2]。目前，生物活性肽表現(xiàn)出的抗氧化、抗癌、抗高血壓和抗菌等特性，使其受到了研究者的廣泛關(guān)注[3]。2019 BIOPEPUWM生物活性肽（前身為BIOPEP）數(shù)據(jù)庫顯示，現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了至少4 300多種生物活性肽，可以根據(jù)它們表現(xiàn)出的不同生物活性對其進(jìn)行分類，例如可將其分為抗菌肽、抗高血壓肽、免疫調(diào)節(jié)肽、抗氧化肽和呈味肽等[4]。

海洋面積約占地球表面積的70%，為人們提供了大量的生物資源，其豐富的魚類資源、甲殼類資源、軟體類動物資源等為人們提供了豐富的生物活性肽來源。水產(chǎn)品是人類重要的食物來源，在食物結(jié)構(gòu)中占據(jù)重要的地位，據(jù)統(tǒng)計(jì)，2019年全國水產(chǎn)品總產(chǎn)量為6 480.36萬t[5]。目前，國內(nèi)外許多研究人員已從水產(chǎn)品及其副產(chǎn)品中提取出了具有各種功能的生物活性肽，例如WANG等[6]通過蛋白酶從鰱魚中提取出了抗氧化肽；宋茹[7]以黃鯽為原料，利用蛋白酶制備出了抗菌肽。本文簡述了水產(chǎn)品及其副產(chǎn)品中生物活性肽的制備、分離純化、鑒定以及其功能活性，為進(jìn)一步研究水產(chǎn)品中的生物活性肽提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 水產(chǎn)品中生物活性肽的制備

水產(chǎn)品中生物活性肽的制備一般是通過蛋白質(zhì)降解的方法，其主要包括化學(xué)法水解和酶水解。

1.1 化學(xué)法水解

化學(xué)法水解是一種較為傳統(tǒng)的水解蛋白質(zhì)的方法，主要有酸水解法和堿水解法。其原理就是通過一定的酸或堿與蛋白質(zhì)的肽鍵發(fā)生反應(yīng)，從而制備出一些具有活性的多肽。雖然化學(xué)法水解的成本低、操作簡單，但反應(yīng)條件劇烈，容易造成環(huán)境污染，且會破壞氨基酸而不利于多肽活性的維持[8]。酸水解快速且徹底，會形成大量游離氨基酸和少量小肽，主要用于生產(chǎn)調(diào)味品。堿水解時，易與精氨酸、絲氨酸等氨基酸發(fā)生作用，從而導(dǎo)致營養(yǎng)成分流失[9]。

1.2 酶水解法

酶水解法就是利用胰酶、胃蛋白酶和堿性蛋白酶等蛋白水解酶從魚肉蛋白中得到相應(yīng)的多肽，目前采用的酶解法一般有單酶水解法和兩種及以上蛋白酶的復(fù)合酶解法。張崟等[10]對采用酶解技術(shù)從畜禽及水產(chǎn)品加工副產(chǎn)物中制備肽進(jìn)行了綜述。但酶水解法與蛋白酶的選擇、水解時間以及溫度有關(guān)，不同的條件會對水解的程度造成不同的影響，從而影響生成肽的類型[11]。表1為不同蛋白酶在水產(chǎn)品中適宜的反應(yīng)條件，但是目前還沒有已知的產(chǎn)生特定生物活性肽的特定酶[12]。與化學(xué)水解法相比，酶解法更加方便快捷、環(huán)保無污染、高效安全，隨著我國對環(huán)保問題的重視，酶解法也必將得到廣泛的應(yīng)用[13]。

表1 不同蛋白酶在水產(chǎn)品中適宜的反應(yīng)條件表

2 水產(chǎn)品中生物活性肽的分離純化

水產(chǎn)品中通過蛋白質(zhì)降解法提取出來的多肽量少且雜質(zhì)較多。而通過分離純化后，提取出來的多肽具有較高的生物活性與純度。目前水產(chǎn)品中生物活性肽的提取方法主要有超濾、凝膠過濾色譜法、離子交換色譜和反相高效液相色譜技術(shù)[14]。

2.1 超濾技術(shù)

超濾技術(shù)是納米級薄膜分離技術(shù)，以薄膜兩側(cè)的壓力差為驅(qū)動力，使溶液通過濾膜孔徑時能夠達(dá)到分離、提純、濃縮的目的。超濾法操作簡單，目前已廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)品中肽的研究，如陳思謹(jǐn)[15]通過使用超濾技術(shù)從紅鼓魚魚鱗酶解液中分離得到了純度達(dá)95%的紅鼓魚魚鱗中Ⅰ型膠原蛋白。超濾技術(shù)是一種高新技術(shù)，具有高效、低能耗、效果穩(wěn)定以及無污染的優(yōu)點(diǎn)，但是這種技術(shù)只適用于初步分離肽，而不能分離得到具體的某一種肽[16]。

2.2 凝膠過濾色譜法

凝膠過濾色譜法也就是分子排阻色譜法。其主要原理是利用凝膠作用將分離物質(zhì)按照不同的分子大小進(jìn)行分離，從而達(dá)到分離純化的目的。該方法所使用的凝膠是一種惰性載體，不帶電荷，分離效果好。且該方法在分離過程中不需要有機(jī)溶劑，所以產(chǎn)物不易變性。但該方法一般需要結(jié)合其他分離純化方法一起使用，才能得到更高活性、更高純度的多肽[17]。凝膠層析主要應(yīng)用于蛋白質(zhì)相對分子量的測定及其分離純化，也逐漸應(yīng)用于水產(chǎn)及其副產(chǎn)物的蛋白酶解分離[18]。陳宏[19]將樣品上樣于超純水平衡好的Sephadex G-15凝膠柱（1.5 cm×100 cm），測定出了牡蠣樣品中各組分中多肽的濃度以及各組分對DPP-IV的IC50值。

2.3 離子交換色譜法

離子交換色譜法是指利用固定相中的帶電基團(tuán)與蛋白質(zhì)、多肽分子帶電基團(tuán)不同，在一定酸堿條件下，不同帶電基團(tuán)與固定相和流動相的結(jié)合力不同，使得固定相上帶電物質(zhì)與流動相中的離子發(fā)生交換[20]。目前離子交換色譜在水產(chǎn)品及其副產(chǎn)品中運(yùn)用也較廣泛，例如BARBARA等[21]用離子交換色譜法分析鱈魚片中添加的磷酸鹽，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IMP和ADP分別影響三偏磷酸鹽和二磷酸鹽的定量。

2.4 反相高效液相色譜法

反相高效液相色譜是目前水產(chǎn)品分離純化多肽較常用的方法，是將極性流動相與非極性固定相組成一種液相色譜體系。主要原理是利用流動相極性的變化，非極性的固定相與非極性的多肽分子的結(jié)合效果減弱，使得溶質(zhì)分子脫離純化[22]。例如，HU等[23]在Zorbax SB-C18柱上使用反相高效液相色譜進(jìn)一步純化凝膠過濾色譜分離后抗氧化活性最高的成分，得到對DPPH自由基清除活性最高的B3成分（P＜0.05）。

3 水產(chǎn)品中生物活性肽的鑒定

通常采用質(zhì)譜技術(shù)、電泳技術(shù)以及多種儀器聯(lián)用等技術(shù)來鑒定水產(chǎn)品及其副產(chǎn)物中分離純化后的生物活性肽。質(zhì)譜法（Mass Spectrometry，MS）是通過質(zhì)譜儀將多肽分解為不同質(zhì)荷比的離子，再利用電場和磁場將不同質(zhì)荷比的離子分開。質(zhì)譜分析具有分離效果好、靈敏度高、準(zhǔn)確度高的優(yōu)點(diǎn)，一般能與其他儀器聯(lián)用，如電噴霧電離質(zhì)譜、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜和基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜等。

電泳技術(shù)是根據(jù)多肽和蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量以及等電點(diǎn)的不同進(jìn)行鑒定的方法。電泳法操作簡單，可以快速得到多肽的大概信息，但只能了解到多肽的相對分子質(zhì)量以及等電點(diǎn)，不能得到多肽的具體序列，因此無法應(yīng)用在新生物活性肽的鑒定方面。

4 水產(chǎn)品中生物活性肽的功能活性

4.1 抗氧化性

在日常生活中，人的機(jī)體內(nèi)會不可避免的產(chǎn)生自由基，這些自由基會與體內(nèi)的一些生物大分子發(fā)生反應(yīng)而產(chǎn)生氧化物。有研究表明，癌癥、衰老、糖尿病等與過量自由基的產(chǎn)生有關(guān)[24]。抗氧化肽是一種能夠減緩或者抑制自由基發(fā)生氧化反應(yīng)的物質(zhì)，尹天旸[25]從草魚酶解液中制備出了抗氧化肽（WEPH），濃度為1 mg·mL-1時，對DPPH自由基的清除率能夠達(dá)到73.52%，表現(xiàn)出良好的抗氧化活性。

4.2 抗菌性

抗菌肽具有抗細(xì)菌、真菌、病毒等作用，能夠促進(jìn)傷口愈合，增強(qiáng)免疫功能。水產(chǎn)品及其副產(chǎn)物可以為人們提供豐富的生物活性肽資源，從中可以得到多種抗菌肽。王焙等[26]通過酸性蛋白酶從鰹魚暗色肉酶解液中制備了抗菌肽，并發(fā)現(xiàn)其對大腸桿菌具有較好的抑菌效果，抑菌率為（79.56±1.56）%。抗菌肽因具有極高的抗菌活性，目前已被廣泛應(yīng)用在生物醫(yī)藥以及食品領(lǐng)域。

4.3 降高血壓

降血壓肽的作用原理是通過抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶的活性，使血管緊張素Ⅰ不能轉(zhuǎn)變?yōu)檠芫o張素Ⅱ，從而達(dá)到降血壓的目的。降血壓肽安全無副作用，目前已被廣泛應(yīng)用于高血壓治療上。LIN等[27]通過復(fù)合蛋白酶水解軍曹魚皮，所得水解產(chǎn)物（PX-5）對ACE的IC50為0.221 mg·mL-1，其中顯示出降高血壓活性的4種肽的氨基酸序列分別為Trp-Ala-Ala、Ala-Trp-Trp、Ile-Trp-Trp和Trp-Leu。

4.4 其他功能活性

生物活性肽除了具有抗氧化性、抗菌性和降血壓的功能外，還具有其他的功能活性。例如，HARNEDY等[28]從大西洋鮭魚副產(chǎn)物的蛋白質(zhì)水解物中提取出了具有抗糖尿病作用的肽；HOU等[29]從南極磷蝦蛋白水解物中提取出了一種可以促進(jìn)人體鈣吸收的鈣螯合肽（Val-Leu-Gly-Tyr-Ile-Gln-Ile-Arg）。

5 結(jié)語

水產(chǎn)品包含淡水和海洋中的魚類、甲殼類、軟體類及其加工的產(chǎn)品，資源豐富，因此水產(chǎn)品中的生物活性肽具有豐富的來源和多樣性。本文簡述了水產(chǎn)品中生物活性肽的制備、分離純化、鑒定方法以及其功能活性，發(fā)現(xiàn)目前對于水產(chǎn)品中生物活性肽的研究還存在以下幾方面不足。①對于目前所研究出來的生物活性肽大多數(shù)只是在小鼠上進(jìn)行生物活性實(shí)驗(yàn)和體外實(shí)驗(yàn)，但還缺乏一定的臨床應(yīng)用。②大多數(shù)研究都還只是理論研究，缺乏實(shí)際應(yīng)用。③研究領(lǐng)域不平衡，大多數(shù)研究集中在對水產(chǎn)品中抗氧化肽的研究，對其他方面的研究較少，如對抗疲勞肽的研究。此外，研究的水產(chǎn)品種類不夠豐富，還有許多水產(chǎn)種類還需要相關(guān)學(xué)者去研究。隨著研究的深入，相信這些問題在未來會得到解決。