雞環狀RNA circSESN1的表達特性探究

邵冰豪，高林歌，朱星浩，張懷勇，陳 文，黃艷群

(河南農業大學動物科技學院，鄭州 450002)

環狀RNA(circRNAs)是一種由前體mRNA在反向剪接過程中形成的非編碼RNA。circRNAs 根據來源主要分為四類：由外顯子組成的外顯子環狀RNA；由內含子組成的內含子環狀RNA；外顯子和內含子共同組成的外顯子-內含子環狀RNA；來自基因間區的基因間環狀RNA。circRNAs的分布十分廣泛，在人、動物和植物體內都可以檢測到。此外，circRNAs具有時空表達特性和序列保守性，并且在畜禽的各個組織器官中表達豐度不同。隨著RNA-seq技術的發展，陸續有研究報道circRNAs可以參與基因轉錄后的調控，與蛋白質結合發揮作用，也可以結合microRNA(miRNA)進而調控靶基因的表達以及可以編碼蛋白。近年來，在雞體內發現circRNAs可以參與到肌肉生長發育過程，例如circTMTC1通過吸附miR-128-3p抑制雞骨骼肌衛星細胞的分化；circHIPK3吸附miR-30a-3p從而促進雞成肌細胞增殖分化；circFAM188B可以編碼一種調節雞骨骼肌衛星細胞增殖和分化的蛋白；circSVIL通過吸附miR-203促進雞成肌細胞增殖和分化等。

Sestrins家族中的1、2和3三個基因廣泛存在于哺乳動物的各個組織中，且1在骨骼肌的表達量較高，在分化的肌管也高表達。Sestrins是胰島素和葡萄糖敏感型的基因，可以與GATOR2相互作用，參與mTORC1上游的氨基酸感知通路的負向調控。在小鼠的研究中還發現，Sestrins是促進長期運動對機體代謝和身體耐力產生好處的關鍵整合因子，運動后敲除1的小鼠比野生型小鼠表現出更高的葡萄糖不耐受。此外，還有研究發現，在雞體內miR-16-5p 通過靶向1從而抑制成肌細胞增殖，促進成肌細胞凋亡，抑制成肌細胞分化。1是53基因的主要靶點，下調1后可以減少自噬進而減輕多囊卵巢綜合征。1也是一種抗氧化劑，在氧化應激誘導的細胞增殖和損傷的調節中發揮著不同的作用。此外有研究發現，1基因突變型的秀麗隱桿線蟲的壽命明顯縮短，而且肌細胞會嚴重受損，肌動蛋白纖維異常彎曲。

目前尚未見關于1的環狀RNA的相關報道。本課題組前期從肉雞和烏雞胸肌的高通量測序數據(數據未發表)中發現了一個由1外顯子形成的circRNA(circSESN1)。本研究通過鑒定雞體內circSESN1，預測circSESN1的潛在性功能，檢測雞circSESN1的時空表達特性，并對雞進行胰島素、葡萄糖、丙酮酸鈉和飼糧限飼等外源性刺激探究circSESN1在雞體內的表達調控特性。為今后深入研究雞circSESN1在胰島素代謝和肌肉發育過程中的作用奠定基礎。

1 材料方法

1.1 試驗動物

試驗一：取絲羽烏骨雞(烏雞)種蛋(=50)進行孵化，在孵化期間分別挑選10胚齡(E10)和19胚齡 (E19)烏雞各4只采集胸肌組織，剩余雞胚繼續孵化，出殼后自由采食、自由飲水，飼糧配制參考《雞飼養標準》(NY/T 33—2004)，光照時間為23 h·d， 出殼后第1周雞舍溫度控制在33～35 ℃， 以后每周溫度遞減2～3 ℃。飼喂至21日齡 (21 d)時，分別挑選4只雄性烏雞，采集其心、肝、肌胃、腺胃、胸肌、腿肌、腦和胰腺8個組織樣；飼養至49日齡(49 d)時，挑選4只雄性烏雞，采集胸肌組織，均迅速凍于液氮后-80 ℃保存。

試驗二：1 d艾拔益加雄性肉雞(肉雞)在相同條件下飼養(同試驗一)，并分別選取40只體重相近的肉雞開展葡萄糖耐受試驗(18 d)、丙酮酸耐受試驗(21 d)和胰島素耐受試驗(24 d)，試驗前禁食12 h， 分別于試驗前采集不做處理雞的胸肌樣品為基礎狀態(或0 min，=6)。①葡萄糖耐受試驗：試驗組按照2 g·kg的劑量腹腔注射10%葡萄糖溶液，對照組注射同等劑量的0.9%生理鹽水，分別于注射后10和60 min，采集6只雞胸肌組織樣品。②丙酮酸耐受試驗：試驗組按照2 g·kg的劑量腹腔注射丙酮酸鈉(用0.9%生理鹽水稀釋)，對照組注射等劑量的0.9%生理鹽水，注射后60 min采集6只雞的胸肌組織。③胰島素耐受試驗：試驗組按照0.05 mL·kg的劑量腹腔注射胰島素，對照組腹腔注射等劑量的磷酸鹽緩沖液(PBS緩沖液)。試驗所用胰島素用PBS進行稀釋(胰島素∶PBS=1∶9)，在胰島素和PBS注射后15、120和240 min分別采集6只雞的胸肌組織。所有采集的樣品迅速于液氮冷凍后轉移到-80 ℃冰箱保存。

試驗三：1 d的艾拔益加肉雞于相同條件下飼養，飼糧配方參照本實驗室前期研究的限飼配方。飼喂至7 d時隨機挑選30只體重相近的雌性肉雞分為3組(對照組、15%能量限飼組和15%蛋白限飼組)。對照組飼喂常規日糧，自由采食；15%能量限飼組自由采食能量限制飼糧(代謝能是對照組的85%，其它各營養水平與對照組相同)；15%蛋白限飼組自由采食蛋白限制飼糧(粗蛋白質含量是對照組的85%，其它各營養水平均與對照組相同)，飼養試驗進行至21 d時，每組各采集10只雞胸肌組織。采集的組織樣品迅速放于液氮中，轉移至-80 ℃冰箱保存。

1.2 引物設計與合成

采用Primer Premier 5.0軟件，根據circSESN1剪接位點附近100～200 bp序列設計背靠背引物擴增circSESN1，并設計面對面引物擴增1(登錄號：XM_004940327.4)和-(登錄號：NM_205518.1)，引物序列見表1。委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成引物。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.3 DNA、RNA提取和RNA反轉錄

按照動物組織基因組DNA小量提取試劑盒(萊楓，上海)說明書要求，提取21 d烏雞肝組織中的基因組DNA。采用TRIzol法提取各個組織樣品的RNA，利用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的質量與完整性，利用分光光度計測定RNA的濃度以及OD 260/280 nm。參照HiScriptⅢ 1 st Strand cDNA Synthesis Kit(+gDNA wiper)(諾唯贊，南京)說明書進行RNA的反轉錄。反轉錄過程分為兩步，第一步首先去除基因組DNA：Total RNA 1 μg、5× gDNA wiper Mix 2 μL，用ddHO補充至10 μL，于42 ℃孵育 2 min。第二步合成cDNA：第一步的混合液10 μL、10× RT Mix 2 μL、HiScript Ⅲ Enzyme Mix 2 μL、Oligo(dT)VN 1 μL、 Random hexamers 1 μL、ddHO 4 μL，于37 ℃孵育15 min，85 ℃孵育5 s。得到的cDNA保存于-20 ℃備用。

1.4 RNase R酶處理

將提取21 d烏雞肝組織RNA樣品分為兩份，一份參照RNase R酶試劑(吉賽，廣州)說明書進行RNase R 酶處理(RNase R+)；另一份作為對照(RNase R-)。處理組在2 μg RNA中加入6 U RNase R酶，對照組加入等量緩沖液，于37 ℃孵30 min， 然后于70 ℃，10 min使酶失活后直接進行逆轉錄反應。

1.5 qRT-PCR

以-為內參基因，使用熒光定量PCR儀(Light Cycler96，美國)進行qRT-PCR，qRT-PCR反應體系(10 μL)包括：cDNA 1 μL，上、下游引物各0.2 μL，2× ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 5 μL(諾唯贊，南京)，加ddHO補充體系至10 μL， 反應程序：95 ℃ 30 s，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，共35個循環。在qRT-PCR試驗中均設置3個生物學重復和3個技術重復進行試驗，設置不添加cDNA的組別為陰性對照。采用2法計算基因的相對表達量。

1.6 潛在性功能預測

通過miRanda軟件預測剪切后的circSESN1和miRNA的結合位點。用Cytoscape軟件構建circSESN1-miRNA互作網絡。利用IRESfinder軟件，尋找circSESN1序列上是否包含內部核糖體進入位點(IRES)信息，分析circSESN1是否具備不依賴5′帽子結構而啟動翻譯的功能，從而對circSESN1的蛋白翻譯潛能進行預測。

1.7 統計分析

采用SPSS 26.0的單因素方差分析和鄧肯法多重比較對試驗數據進行統計分析。<0.05為差異顯著，<0.01為差異極顯著。使用GraphPad Prism 8.0對試驗結果進行繪圖。

2 結 果

2.1 circSESN1的鑒定和成環驗證

高通量測序獲得的circSESN1是由1三個外顯子(XM_004940327.4，位置：510～1 136 bp)反向 剪切形成的環狀RNA，總長627 bp。為了對circSESN1進行鑒定和成環驗證，利用試驗一采集的21 d烏雞肝組織，根據表1的引物信息，對circSESN1和來源基因1進行了RT-PCR擴增(圖1A)。結果發現，在以cDNA為模板時可以同時檢測到circSESN1和1的表達，但以gDNA為模板時僅可檢測到1的表達，而不能檢測到circSESN1的表達。將PCR產物進行Sanger測序后發現circSESN1連接處的測序結果和高通量測序結果相符(圖1B)，與1外顯子反向連接處的序列也一致。從而表明circSESN1是反向剪切成環存在的。對circSESN1與1的穩定性進行檢測(圖1C)，結果發現使用RNase R酶處理后，與對照組相比，線性基因-和1表達量均發生了極顯著的降低(<0.01)，而RNase R酶處理后circSESN1的表達與對照組相比差異不顯著(>0.05)， 表明circSESN1能夠耐受RNase R酶的消化，對于RNase R酶具有較強的抵抗性，也再次證明了circSESN1是以環狀形式真實存在的。

A. circSESN1與來源基因SESN1分別以cDNA和gDNA為模板進行RT-PCR擴增，白色三角形表示circSESN1背對背引物，黑色三角形表示來源基因SESN1面對面引物；B. circSESN1連接位點的Sanger測序驗證；C. circSESN1和SESN1的穩定性檢測。*表示P < 0.05，**表示P < 0.01，ns表示P>0.05。下同A. circSESN1 and source gene SESN1 were amplified by RT-PCR using cDNA and gDNA as templates, respectively. The white triangle represents the divergent primer of circSESN1, and the black triangle indicates the convergent primer of the source gene SESN1. B. Sanger sequencing verification of circSESN1 junction site. C. Stability detection of circSESN1 and SESN1. * means P < 0.05, ** means P < 0.01, ns means P>0.05. The same as below圖1 circSESN1的鑒定和成環驗證Fig.1 Identification and cycling verification of circSESN1

2.2 circSESN1組織表達特性

為了探究circSESN1的組織表達特性，通過qRT-PCR技術檢測了circSESN1和來源基因1在烏雞各個組織中的表達量(圖2A、2B)。結果發現circSESN1和其來源基因1具有相似的組織表達模式，在骨骼肌和胰腺中高表達，在其它組織中低表達。circSESN1在胸肌中的表達極顯著高于其它幾個組織(<0.01)，腿肌和胰腺中circSESN1的表達極顯著高于心、肝、肌胃、腺胃和腦(<0.01)，而circSESN1在心、肝、肌胃、腺胃和大腦的表達無顯著差異(>0.05)。來源基因1在胸肌的表達也極顯著高于其它幾個組織(<0.01)；此外在腿肌和胰腺中1的表達極顯著高于肝、肌胃、腺胃和腦(<0.01)。進一步對雞不同發育階段的胸肌中circSESN1和1的表達特性進行分析(圖2C、2D)，發現circSESN1和其來源基因1隨雞的生長發育表現了相似的變化趨勢，以胚胎發育(E10)早期最低，而在胚胎發育后期和出生后保持相對高的表達。circSESN1在21 d雞胸肌中的表達量最高，極顯著高于E10、E19和49 d胸肌中的表達量(<001)，大約是E10胸肌中表達量的450倍。而1在E19胸肌中表達量高于E10、21和49 d胸肌中的表達量，與E10胸肌中的表達量相比大約提高了20倍。

A. circSESN1在21 d烏雞組織表達譜；B. 來源基因SESN1在21 d烏雞組織表達譜；C. circSESN1在雞不同發育階段胸肌中的表達；D. SESN1在雞不同發育階段胸肌中的表達。不同大寫字母表示基因在不同組織或時間點差異極顯著(P<0.01)，不同小寫字母表示基因在不同組織或時間點差異顯著(P<0.05)，相同字母表示基因在不同組織或時間點差異不顯著(P>0.05)A. The tissue expression profile of circSESN1 on 21 d in silky fowl. B. The tissue expression profile of source gene SESN1 on 21 d in silky fowl. C. The expression of circSESN1 in pectoralis at different developmental stages of chicken. D. The expression of SESN1 in pectoralis at different developmental stages of chicken. Different capital letters indicated extremely significant differences in genes at different tissues or time points (P<0.01). Different lowercase letters indicate significant differences in genes at different tissues or time points (P<0.05). Same letter means no significant difference in gene expression at different tissues or time points (P>0.05)圖2 circSESN1與來源基因SESN1的組織表達特性Fig.2 Tissue expression characteristics of circSESN1 and source gene SESN1

2.3 胰島素、葡萄糖和丙酮酸鈉對circSESN1表達的影響

為了探究外源性刺激對circSESN1表達的影響，首先檢測了胰島素注射對胸肌中circSESN1表達的效應(圖3A)。qRT-PCR結果顯示，胸肌中circSESN1的表達量在胰島素注射后不同時間點呈現出了較大的變化，尤其是在胰島素注射120 min后表達量最高。與0 min相比，在胰島素注射120 min后circSESN1的表達量發生了極顯著升高(<0.01)，同時與注射PBS 120 min后相比也發生了極顯著升高(<0.01)。與0 min基礎狀態相比，在PBS注射后120 min后circSESN1的表達發生了低幅度的升高(<0.05)。使用丙酮酸鈉處理后發現胸肌中circSESN1在注射后60 min與基礎狀態相比沒有發生顯著性變化(>0.05)，與注射生理鹽水的對照組相比也沒有發生顯著性變化(圖3B)。同樣注射葡萄糖不同時間點后circSESN1的表達量沒有顯著性變化(>0.05，圖3C)，與注射生理鹽水的對照組相比也沒有發生顯著性變化(>0.05)。

A. 胰島素處理后對胸肌中circSESN1表達的影響；B. 丙酮酸鈉處理后對胸肌中circSESN1表達的影響；C. 葡萄糖處理后對胸肌中circSESN1表達的影響A. Effect of insulin treatment on circSESN1 expression in pectoralis. B. Effect of sodium pyruvate treatment on circSESN1 expression in pectoralis. C. Effect of glucose treatment on circSESN1 expression in pectoralis圖3 注射胰島素、丙酮酸鈉和葡萄糖對circSESN1表達的影響Fig.3 Effects of insulin, sodium pyruvate and glucose injection on circSESN1 expression

2.4 限飼對circSESN1表達的影響

利用實驗室構建的限飼群體，進一步研究了15%能量限飼和15%蛋白限飼對circSESN1表達的效應(圖4)。結果表明，與對照組相比，15%能量限飼顯著下調了胸肌中circSESN1的表達(<0.05，圖4A)，大約降低了五分之四。15%蛋白限飼處理后與對照組相比胸肌中circSESN1的表達也發生了顯著性降低(<0.05，圖4B)，下調了二分之一左右。

A. 15%能量限飼對胸肌中circSESN1表達的影響；B. 15%蛋白限飼對胸肌中circSESN1表達的影響A. Effect of 15% energy restriction on circSESN1 expression in pectoralis. B. Effects of 15% protein restriction on circSESN1 expression in pectoralis圖4 限飼對肉雞胸肌circSESN1表達的影響Fig.4 Effect of feeding restriction on circSESN1 expression in pectoralis of broilers

2.5 circSESN1-miRNA互作網絡

為了研究circSESN1的功能，對circSESN1的靶向miRNAs進行了功能預測。結果發現，circSESN1可以和71個miRNAs發生互作(圖5)，提示circSESN1可能通過結合miRNA進而發揮作用。

圖5 circSESN1-miRNA互作網絡Fig.5 circSESN1-miRNA interaction network

2.6 circSESN1翻譯蛋白的潛能分析

對circSESN1序列中的IRES信息進行分析，結果發現circSESN1序列上和剪接位點都不存在IRES，評分都在0.5以下(表2)，說明circSESN1不存在潛在的翻譯蛋白能力，而是作為非編碼RNA行使功能。

表2 circSESN1翻譯蛋白潛能分析Table 2 The analysis of protein-coding ability of circSESN1

3 討 論

circRNAs由于結構的特殊性，需要對其進行鑒定是否成環。根據circRNAs反向剪接處的序列，分別設計相應的背對背引物和面對面引物，并檢測以cDNA和gDNA為模板時能否通過PCR擴增出相應的目的條帶。面對面引物在cDNA和gDNA中均能檢測出相應的目的條帶，而背對背引物只在cDNA模板中檢測出相應的目的條帶，在gDNA中檢測不到。與線性基因相比，circRNAs由于不具備5′端和3′端的結構，所以具有較強的穩定性不易被RNase R酶消化。本研究通過使用RNase R酶進行處理后發現circSESN1的表達確實不受RNase R酶的影響。從而證明了circSESN1是反向成環并真實存在的。

已有文獻報道circRNAs可正向調控來源基因發揮功能，如敲低circEIF3 J和circPAIP2后分別導致HeLa和HEK293細胞中來源基因mRNA水平的下降；在食管鱗狀細胞癌中，circITCH作為miRNA海綿從而促進miRNA靶基因的表達。本研究發現，circSESN1和來源基因1具有相似的時空表達模式，提示circSESN1和來源基因1在胸肌中可能存在潛在的協同作用。circSESN1-miRNA互作網絡分析發現，circSESN1具有豐富的miRNA結合位點，推測circSESN1可作為競爭性內源性RNA，通過堿基互補海綿吸附miRNA的方式調控1的表達。在這些存在結合位點的miRNAs中，miR-184和miR-17已報道與胰島素代謝有關，這也預示著circSESN1可能通過與這些miRNAs互作進而調節雞體內胰島素的代謝。circSESN1和其來源基因1均在骨骼肌中高表達，提示其在肌肉發育上的潛在功能。有研究表明，出殼前雞胚的肌肉發育主要源于肌纖維數目的增加，而出殼后肌肉的增加是來源于肌纖維細胞的肥大。本研究發現，circSESN1和其來源基因1在胚胎發育早期(E10)胸肌中低表達，而在胚胎后期(E19)、21和49 d中高表達，也提示其與雞骨骼肌在胚胎后期和出殼后的高速生長發育有關，且已有研究發現1可促進雞成肌細胞增殖，抑制成肌細胞凋亡，誘導成肌細胞分化。

胰島素是維持機體血糖平衡、供給各種組織和器官能量的一類重要激素。circRNAs可以參與胰島素代謝調控，有研究發現環狀RNA Cdr1as通過miR-7及其靶點調控胰島細胞的胰島素分泌，也有研究在果蠅體內鑒定到胰島素敏感型環狀RNA。此外，3可通過mTORC2激活AKT信號通路，從而增強小鼠肝的胰島素敏感性；同時敲減2和3也會引起肝mTORC1-S6K信號通路的激活和胰島素抵抗。本研究發現，circSESN1和其來源基因1均在胰腺組織高表達，且外源胰島素顯著上調了雞胸肌circSESN1(120 min)的表達量。推測1及其形成的circSESN1可能通過影響胰島素的分泌從而參與雞體內的胰島素信號調控。胰島素可促進肌肉葡萄糖的吸收，肌肉葡萄糖可通過糖酵解途徑轉化為丙酮酸，而丙酮酸可通過糖異生轉化為葡萄糖，本研究發現肌肉中circSESN1的表達既非丙酮酸敏感型，也非葡萄糖敏感型的，而是胰島素敏感型的。此外有研究發現，在丙酮酸鈉和葡萄糖注射30 min后血糖濃度變化幅度最大，在60 min的變化不大，這也能進一步解釋本試驗中注射葡萄糖和丙酮酸鈉60 min后，circSESN1的表達量雖然發生了變化但是差異不顯著。本課題組前期的研究還發現，在胰島素注射后120 min內肉雞血糖濃度呈線性下降，并在120 min時降低至最低點。本研究中胰島素注射后胸肌中circSESN1表達呈現出和血糖相反的變化規律，提示雞胸肌circSESN1通過胰島素信號通路對血糖濃度進行負向調控。

限飼會影響雞體內糖代謝。石秀文發現，限飼可以提高肉雞的空腹血糖。在雞線粒體中限飼可以通過改變基因的表達進而降低線粒體DNA拷貝數。本研究中，15%能量限飼和15%蛋白限飼均顯示了和外源胰島素相反的效應，下調了胸肌中circSESN1的表達。Sestrins家族可以通過P53、MAPK、AKT和mTOR等信號通路參與到應激和自噬等機體調控。其中2和3通過AKT和mTOR參與到葡萄糖代謝和胰島素抵抗過程。因此推測，限飼會通過影響相關信號通路進而降低circSESN1的表達。

4 結 論

本研究鑒定了雞體內存在一個不被RNase R酶消化降解、具有高度穩定性的circSESN1，并預測circSESN1存在多個miRNAs結合位點。circSESN1和其來源基因1呈現了相似的時空表達特性，均在骨骼肌和胰腺組織具有較高的表達豐度，其表達也均在雞胚胎發育后期(E19)的胸肌中急劇上升。注射外源胰島素顯著上調胸肌中circSESN1(120 min)的表達，15%能量限飼和15%蛋白限飼均可顯著下調胸肌中的circSESN1的表達。