貓源C11orf96基因表達(dá)及其在細(xì)胞中的定位分析

楊洪早，朱 杰，郭宏元，湯傲星，陳少宇，劉春草，張 達(dá)，袁莉剛*，劉光清*

(1. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，蘭州 730070； 2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241)

本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，1196在貓杯狀病毒(feline calicivirus，F(xiàn)CV)感染貓后顯著上調(diào)。C11orf96為11號染色體上的第96個開放閱讀框所編碼的蛋白，該基因雖有文獻(xiàn)報道，但該蛋白功能未被鑒定。在C11orf96的研究中，基因的克隆與表達(dá)是分子生物學(xué)研究的重要組成部分，而且特異性抗體也是一項重要的研究工具，這些均有助于挖掘蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能。

基于此，本實驗室克隆了貓源1196基因，并以pET-32a(+)載體為基礎(chǔ)，結(jié)合本團隊已制備的羊口瘡病毒 F1L 融合Fe蛋白多克隆抗體的基礎(chǔ)，構(gòu)建了融合鐵蛋白的原核表達(dá)質(zhì)粒pET-32a(+)-f1196-Fe，并進(jìn)行轉(zhuǎn)化得到重組蛋白fC11orf96-Fe，然后用它來免疫新西蘭大白兔制備fC11orf96-Fe的多克隆抗體，為其后續(xù)研究C11orf96蛋白的生物學(xué)功能提供重要工具。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞和菌株 pET-32a(+)、pCMV-HA、pCMV-Myc、貓腎細(xì)胞(Crandell Reese Feline Kidney cells，CRFK)，F(xiàn)e基因質(zhì)粒由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所伴侶動物生物安全風(fēng)險預(yù)警及防控技術(shù)團隊保存。

1.1.2 主要試劑 pEASY-Blunt Zero Cloning Kit vector購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，Lipofectamine3000 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒購自Invitrogen公司，ClonExpressUltra One Step Cloning Kit與ClonExpressMultiS One Step Cloning Kit 購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司，HⅠ、dⅢ、RⅠ和Ⅱ限制性內(nèi)切酶購自NEB公司，文中使用的抗體均購自 Cell Signaling Technology(CST)生物技術(shù)有限公司，其余試劑均為分析純。

1.1.3 實驗動物 6周齡新西蘭大白兔購自上海杰思捷實驗動物有限公司[許可證號碼：SCXX(滬) 2020-0123]。

1.2 方法

1.2.1 基因及載體構(gòu)建 根據(jù)NCBI提供貓1196的基因預(yù)測序列，利用 Primer 6.0軟件設(shè)計特異性引物用于擴增貓1196基因以及構(gòu)建相應(yīng)的原核表達(dá)和真核表達(dá)載體，引物序列(由蘇州金唯智生物科技有限公司合成)見表1。……