青蒿琥酯通過Keap1/Nrf2通路抑制氧化應激改善犬急性腎損傷的體內外分析

陸 江，朱道仙，劉 莉，郝福星，吳 植，傅宏慶

(1.江蘇農牧科技職業學院寵物科技學院，泰州 225300； 2.江蘇農牧科技職業學院動物醫學院，泰州 225300； 3.江蘇省獸用生物制藥高技術研究重點實驗室，泰州 225300)

近年來，急性腎衰竭已成為危害我國寵物犬貓健康的一種常見病。急性腎損傷(acute kidney injury, AKI)是導致其發生的主要因素，AKI可導致腎功能急劇下降，繼而引起代謝產物在體內迅速積聚，水、電解質和酸堿平衡紊亂，出現氮質血癥等，病情嚴重，死亡率高，且目前尚無有效的治療方法。氧化應激反應是造成急性腎損傷的主要病理因素，其導致的病理損傷貫穿于多種腎病發生、發展的過程中。因而抑制氧化應激反應發展是防治急性腎損傷的關鍵。Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白1/核因子E2相關因子2(Keap1/Nrf2)信號通路可激活下游抗氧化代謝酶靶基因的轉錄表達，從而提高機體抗氧化能力，減輕氧化應激損傷。

青蒿琥酯(artesunate, ART)是青蒿素的衍生物，是一種安全有效的抗瘧藥，而且還具有抗氧化應激、抗炎、抗腫瘤及免疫調節等作用。青蒿琥酯可減輕煙草煙霧暴露小鼠肺組織氧化損傷，改善小鼠肺功能。但青蒿琥酯是否可通過抑制氧化應激改善犬急性腎損傷及其作用機制，目前尚未清晰。因此，本研究采用慶大霉素(gentamicin，GM)誘導犬急性腎損傷和MDCK細胞損傷，通過體內外試驗觀察青蒿琥酯對GM誘導犬急性腎損傷的治療作用及機制，為臨床治療提供合理用藥依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

泰迪型貴賓犬，4歲左右，體重(7±1)kg，雄性，健康狀況良好，免疫及驅蟲程序齊全，購于江蘇農牧科技職業學院寵物美容犬房。實驗動物使用許可證為SYXK(蘇) 2021-0037。

1.2 細胞株

MDCK(犬腎)細胞(中國科學院上海生命科學研究院細胞庫提供)。1基因過表達MDCK細胞由感染轉染1質粒的慢病毒而成，記為M-K細胞。Nrf2敲減表達MDCK細胞由轉染Nrf2的siRNA(靶序列5′-GACATGGATTTGATTGACATACT-3′)而成，記為M-SiNrf2細胞。M-K細胞和M-SiNrf2細胞基因表達均經RT-qPCR驗證。

1.3 試劑

青蒿琥酯及硫酸慶大霉素購自美國Sigma-Aldrich公司。ML385購自上海芮暉化工科技有限公司，活性氧、總過氧化物歧化酶(T-SOD)、丙二醛(MDA)和谷胱甘肽(GSH)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。兔源抗Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白1(Keap1)、核因子E2相關因子2(Nrf2)、血紅素氧合酶1(HO1)、谷胱甘肽半胱氨酸連接酶催化亞基(GCLC)和β-actin等抗體及HRP標記山羊抗家兔IgG抗體均購自英國Abcam公司。

1.4 動物試驗

1.4.1 試驗設計 選取20只泰迪型貴賓犬，以商品化成年犬糧(冠能成年犬犬糧，規格12 kg·袋，雀巢普瑞納寵物食品有限公司)進行7 d適應性飼喂后，隨機等分成4組：對照組(Control)、慶大霉素模型組(GM)、青蒿琥酯治療組(GM+ART)、青蒿琥酯+ML385干預組(GM+ART+ML385)。除對照組外，其他各組犬參考張萍等方法，每天上午9:00按照40 mg·kg體重肌肉注射慶大霉素，連續5 d，若血清肌酐(Cr)及臨床癥狀無明顯變化，則按體重以40 mg·kg間隔12 h重復給藥，直至Cr>270 μmol·L，尿素氮(UN)升高，停止用藥，犬急性腎損傷模型建立成功。然后，GM+ART組每天按體重以10 mg·kg肌肉注射青蒿琥酯，GM+ART+ML385組每天按體重以10 mg·kg肌肉注射青蒿琥酯的同時注射ML385(30 mg·kg)，GM組和Control組注射等量生理鹽水作為對照。第12天時，停止給藥。在整個試驗過程中，一犬一籠進行飼喂管理，每天上午09:00和下午16:00各喂食1次，且每天在寵物訓練場自由活動15 min，此外所有的犬可自由飲水。

1.4.2 血清腎功能生化指標測定 分別于試驗前第0天及試驗第3、6、9與12天的上午8:00，空腹采血并制備血清，用生化分析儀測定血清肌酐(Cr)和尿素氮(UN)含量，按ELISA試劑盒(上海聯邁生物工程有限公司)操作說明測定腎損傷因子-1(KIM-1)含量。

1.4.3 腎組織中氧化應激水平測定 試驗結束時，各組隨機選取3只犬用10%氯化鉀注射液靜脈推注致死，分別取右側腎組織0.2 g，加入1 mL RIPA裂解液和蛋白酶抑制劑，在冰盒上用玻璃勻漿器研磨，12 000 r·min離心15 min，取上清液提取總蛋白，-80 ℃保存備用。按照試劑盒的步驟使用酶標儀在550 nm處通過比色法測定腎組織勻漿中總超氧化物歧化酶(T-SOD)、丙二醛(MDA)和谷胱甘肽(GSH)水平。

1.4.4 Western blot檢測腎組織中Kelch樣ECH相關蛋白1(Keap1)、核因子E2相關因子2(Nrf2)及谷胱甘肽半胱氨酸連接酶催化亞基(GCLC)蛋白表達 取“1.4.3”中腎組織勻漿上清液，BCA法測定蛋白濃度，然后用10%的SDS-PAGE電泳膠將蛋白樣品進行電泳分離，再轉印至PVDF膜上，分別加入Keap1(1∶1 000)、Nrf2(1∶1 000)、GCLC(1∶500)、和β-actin(1∶1 000)抗體在4 ℃搖床中孵育過夜。次日，加山羊抗家兔IgG抗體(1∶5 000)室溫下孵育1 h后，在化學發光成像儀中顯影成像。以β-actin為內參，采用Image J分析軟件對各組條帶的光密度值進行測定，以對照組數值為標準化進行分析。試驗重復3次，取平均值。

1.5 細胞試驗

1.5.1 細胞培養 將MDCK細胞接種于DMEM培養基，置于5% CO培養箱中37 ℃培養，定時換液，待細胞密度達90%后用0.25%胰蛋白酶進行細胞消化、傳代處理。細胞融合至80%時，即為處于對數生長期的待試驗細胞。

1.5.2 細胞MTT活性檢測 取“1.5.1”中的細胞，按每孔100 μl接種于96孔培養板中。然后分成對照組(加等量PBS)、GM試驗組(分別加入1.0、2.0、4.0、8.0 mmol·LGM)、ART試驗組(0.5、5.0、50.0 μmol·LART)。培養24 h后，按20 μL·孔加入MTT繼續培養4 h，然后棄去培養液，加入200 μl DMSO工作液，震蕩10 min充分混勻，570 nm處測定各孔A值。每組設置6次重復，計算細胞增殖率=A試驗/A對照×100%。

1.5.3 ART對GM誘導的MDCK細胞的影響 取“1.5.1”中的細胞，按每孔100 μL接種于96孔培養板中。然后分成對照組(加等量PBS)、GM對照組(加4.0 mmol·LGM)、GM+低劑量ART干預組(4.0 mmol·LGM+0.5 μmol·LART)和GM+高劑量ART干預組(4.0 mmol·LGM+50.0 μmol·LART)，共培養24 h，每組設置6次重復，用于后續試驗。細胞活性檢測方法同“1.5.2”。

1.5.4 活性氧(ROS)檢測 將“1.5.3”中細胞加入DCF-DA工作液，按照DCF-DA檢測試劑盒說明進行，然后用熒光顯微鏡觀察熒光強度，以對照組為標準化，利用Image J分析。

1.5.5 T-SOD及GSH檢測 將“1.5.3”中細胞用300 μL細胞裂解液，4 ℃ 12 000 r·min離心10 min，收集上清用BCA法測定蛋白含量，參照T-SOD和GSH試劑盒說明書進行T-SOD及GSH檢測。

1.5.6 qRT-PCR檢測 取“1.5.3”中細胞，用TRIzol法提取細胞總RNA，通過逆轉錄合成cDNA 并用于實時熒光PCR擴增。靶基因的引物由上海生工生物工程有限公司合成(表1)。以β-肌動蛋白(β-actin) 為內參基因，PCR擴增35個循環：95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s。每個樣本進行3次平行，以對照組表達量進行歸一化處理，目的基因 mRNA 的相對表達量用 2-ΔΔ法計算。

表1 熒光定量PCR引物序列Table 1 Primer sequences for quantitative real-time PCR

1.5.7 Western blot檢測 收集“1.5.3”中細胞，經胰酶消化后，加入含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液，冰上裂解 30 min后，再4 ℃以12 000 r·min離心 10 min，收集上清，BCA法檢測蛋白濃度。將各組蛋白濃度調至一致，置于-80 ℃備用。然后用Western blot檢測相關蛋白表達，方法同“1.4.4”。

1.6 細胞驗證試驗

將MDCK、M-K與M-SiNrf2細胞分別接種于96孔培養板中，每孔100 μL。每種細胞分成3組，對照組(加等量PBS)、GM組(加4.0 mmol·LGM)，ART組(加4.0 mmol·LGM和50.0 μmol·LART)，每組設置6次重復，共育24 h，用于后續試驗。然后，用MTT法檢測細胞活性，“1.5.3”方法檢測細胞活性氧(ROS)，Western blot法檢測Keap1/Nrf2通路相關蛋白表達。

1.7 數據分析

試驗數據以(“平均數±標準差”)表示，兩組間數據采用SPSS 23.0進行檢驗比較，<0.05表示差異顯著，<0.01表示差異極顯著。

2 結 果

2.1 ART對GM誘導犬急性腎損傷的影響

由圖1可知，與對照組比較，GM組的血清Cr、UN及KIM-1水平逐漸升高；GM+ART組和GM+ART+ML385組血清Cr、UN及KIM-1水平前6 d逐漸升高，然后呈降低趨勢；第12天時，GM+ART組的Cr、UN及KIM-1水平均極顯著低于GM組，說明ART可以改善GM誘導犬急性腎損傷的腎功能，但給予Nrf2抑制劑ML385后可減弱這些變化(<0.01，圖1A、B、C)。與GM組及GM+ART+ML385組比較，GM+ART組腎組織中GSH水平升高(<0.01，圖1D)，T-SOD活性升高(<0.01，圖1E)，MDA水平降低(<0.01，圖1F)，說明ART提高了GM誘導犬急性腎損傷腎抗氧化能力，這種作用可被ML385逆轉。與GM組比較，GM+ART組腎組織中Keap1蛋白表達下調(<0.05)，Nrf2及GCLC蛋白表達上調(<0.01)；與GM+ART組比較，GM+ART+ML385組腎組織中Nrf2及GCLC蛋白表達下調(<0.01，圖1G、H)。

A、B、C分別為血清中Cr、UN及KIM-1含量；D、E、F分別為腎組織中GSH含量、T-SOD活性及MDA含量；G、H為Keap1、Nrf2及GCLC的Western blot 結果。*.P<0.05；**.P<0.01，下同A, B and C. The content of Cr, UN and KIM-1 in serum; D, E and F. The GSH content, T-SOD activity and MDA content in kidney; G and H. Western blot results of Keap1, Nrf2 and GCLC. *.P<0.05；**.P<0.01, the same as below圖1 ART改善GM誘導犬急性腎損傷的腎功能、降低腎組織的氧化應激水平并激活Keap1/Nrf2通路Fig.1 ART improved renal function, reduce oxidative stress and activate Keap1/Nrf2 pathway in acute kidney injury induced by GM

2.2 ART對GM脅迫下MDCK細胞活性的影響

由圖2可知，GM濃度在1.0～8.0 nmol·L時，與對照組比較，隨著GM水平增加，MDCK增殖率逐漸降低(圖2A)，而ART對MDCK增殖率無顯著影響(圖2B)。當加入4.0 mmol·LGM后,MDCK細胞增殖率降低，同時,加入ART后,可提高細胞增值率，呈劑量依賴關系，以50.0 μmol·LART效果最佳(圖2C)。

A.GM對MDCK細胞增殖影響；B.ART對MDCK細胞增殖影響；C.GM+ART對MDCK細胞增殖影響A.Effect of GM on viability of MDCK cell; B.Effect of ART on viability of MDCK cell; C.Effect of GM+ART on viability of MDCK cell圖2 ART提高GM脅迫下MDCK細胞的活性Fig.2 ART improved the activity of MDCK cells under GM stress

2.3 ART對GM誘導MDCK細胞氧化應激的影響

GM能導致細胞ROS水平顯著升高，與GM組(4.0 mmol·L)比較，加入低劑量ART(5.0 μmol·L) 及高劑量ART(50.0 μmol·L)均可使綠色熒光顯著降低(<0.01，圖3A、B)。說明ART能夠抑制GM誘導MDCK細胞產生ROS。與對照組(未加GM和ART)比較，GM組的T-SOD活性及GSH含量升高(<0.05)；與GM組比較，GM+高劑量ART組的T-SOD活性及GSH含量進一步升高(<0.05，<0.01，圖3C、D)。

A.DCF-DA熒光染色結果；B.DCF-DA熒光染色強度；C.T-SOD活性；D.GSH含量A.the results of DCF-DA fluorescence staining; B.fluorescence intensity of DCF-DA; C.T-SOD activity; D.GSH content圖3 ART提高GM脅迫下MDCK細胞的抗氧化應激能力Fig.3 ART enhanced the antioxidant capacity of MDCK cells under GM stress

2.4 ART對GM脅迫下MDCK細胞Keap1/Nrf2通路的影響

與對照組比較，GM組1基因mRNA表達顯著下調，2、1及基因mRNA表達顯著上調(<0.05)；與GM組比較，GM+高劑量ART組(GM+50.0 μmol·LART)1基因mRNA表達顯著下調(<0.05)，2、1及基因mRNA表達顯著上調(<0.01)，GM+低劑量ART組(GM+5.0 μmol·LART)2和1基因mRNA表達顯著上調(<0.05)，見圖4A。與對照組比較，GM組Keap1蛋白表達顯著下調，Nrf2、HO1及GCLC蛋白A表達顯著上調(<0.05)；GM組比較，GM+高劑量ART組和GM+低劑量ART組Keap1蛋白表達均顯著下調(<0.05)，Nrf2、HO1及GCLC蛋白表達顯著上調(<0.01，<0.05，圖4B、C、D、E、F)。

A. Keap1、Nrf2、HO1及GCLC的mRNA相對表達量；B. Keap1、Nrf2、HO1及GCLC蛋白Western blot結果；C、D、E及F.Keap1、Nrf2、HO1及GCLC相對表達量A. The relative mRNA expression levels of Keap1, Nrf2, HO1 and GCLC; B. Western blot analysis of Keap1, Nrf2, HO1 and GCLC; C, D, E and F. Relative expression levels of Keap1, Nrf2, HO1 and GCLC, respectively圖4 ART對GM脅迫下MDCK細胞Keap1/Nrf2通路相關分子表達的調節Fig.4 Regulation of ART on the expression related molecules of Keap1/Nrf2 pathway in MDCK cells under GM stress

2.5 抑制Keap1/Nrf2通路減弱ART對GM脅迫下MDCK細胞的保護作用

與MDCK細胞比較，M-K細胞Keap1基因mRNA表達顯著上調(<0.01)，M-SiNrf2細胞Nrf2基因mRNA表達顯著下調(<0.01，圖5A)，這說明M-K細胞過表達Keap1，M-SiNrf2細胞敲低Nrf2表達是成功的。由圖5B可知，在MDCK細胞中，與GM組比較，GM+ART組細胞增殖率顯著升高，而在M-K細胞和M-SiNrf2細胞中無顯著差異。在MDCK細胞中，GM+ART組DCF-DA熒光強度顯著低于GM組，而在M-K細胞和M-SiNrf2細胞中，GM+ART組細胞增殖率與GM組無統計學差異(圖5C)。在MDCK細胞中，與GM組比較，GM+ART組Keap1蛋白表達下調，Nrf2、HO1及GCLC蛋白表達上調(<0.01)，而在M-K細胞和M-SiNrf2細胞中GM組與GM+ART組各蛋白表達無統計學差異；在相同處理下(GM+ART)，與MDCK細胞比較，M-K細胞和M-SiNrf2細胞Keap1蛋白表達上調，Nrf2、HO1及GCLC蛋白表達下調(<0.05，圖5D、E、F、G、H)。這說明過表達Keap1和敲低Nrf2，可減弱ART對GM脅迫下MDCK細胞的保護作用。

A. Keap1及Nrf2的mRNA相對表達量；B. 細胞增殖；C. DCF-DA相對熒光強度；D. Keap1、Nrf2、HO1及GCLC蛋白Western blot結果；E、F、G及H.Keap1、Nrf2、HO1及GCLC相對表達量A. The relative mRNA expression levels of Keap1 and Nrf2; B. Cell viability; C. Fluorescence intensity of DCF-DA; D. Western blot analysis of Keap1, Nrf2, HO1 and GCLC; E, F, G and H. Relative expression levels of Keap1, Nrf2, HO1 and GCLC, respectively圖5 抑制Keap1/Nrf2通路減弱ART對GM脅迫下MDCK細胞的保護作用Fig.5 Inhibition of Keap1/Nrf2 pathway attenuates the protective effect of ART on MDCK cells under GM stress

3 討 論

ROS作為氧化應激反應的核心分子，參與細胞壞死、凋亡及自噬，過量ROS會造成組織氧化損傷、炎癥、纖維化等，是多種疾病發生的主要原因。慶大霉素可以導致多種細胞的ROS過量產生，誘導氧化應激反應而發生損傷。本研究細胞試驗結果顯示，GM可導致MDCK細胞ROS水平升高，細胞增殖率降低，ART可降低GM誘導MDCK細胞ROS水平，提高細胞增殖率；動物試驗結果也表明，GM可引起犬腎組織T-SOD及GSH等抗氧化物質減少，脂質過氧化中間產物MDA增多，血中腎功能指標Cr、UN及KIM-1水平均升高，給予ART可提高GM誘導急性腎損傷犬抗氧化能力，降低血中腎功能指標水平。KIM-1是一種上皮細胞的黏附因子，已成為腎損傷的早期診斷指標。說明青蒿琥酯對GM引起犬急性腎損傷具有保護作用，可能與抑制氧化應激有關。

Keap1/Nrf2信號通路在氧化應激反應中發揮重要的作用。在正常生理狀態下，Nrf2與Keap1以復合物形式存在于細胞質內，維持低含量非活性的穩定狀態。激活后，Nrf2從Keap1上解離，進入細胞核，激活下游HO1、GCLC及COX-2等多種把基因的表達。HO1可以減輕血紅素介導氧化應激，是一種抗氧化損傷的重要防御性因子。GCLC是谷氨酸-半胱氨酸連接酶(GCL)的亞基，通過調節GSH的表達，發揮抗氧化作用。小鼠鉛中毒時，肝腎組織中1 mRNA水平顯著提高，2和-1 mRNA水平降低，表明鉛暴露會干擾Nrf2通路，抗氧化能力受到抑制，引起肝、腎損傷；灌胃柴胡多糖可激活Nrf2通路，通過激活Keap1 / Nrf2 / HO-1途徑，并降低炎癥程度來預防肝、腎損傷。有研究表明，2基因的缺失加重單側輸尿管梗阻所致的腎組織損傷和腎纖維化進程。還有研究發現，5/6腎切除大鼠殘余腎組織中Nrf2及其靶基因的表達顯著下調，并出現腎間質纖維化及炎癥反應。本研究結果表明，無論是實驗犬還是MDCK細胞，GM都能引發氧化應激反應，當用ART處理后，能夠激活Keap1/Nrf2信號通路，提高下游抗氧化靶基因表達，使機體的T-SOD、GSH等抗氧化物質含量增高，顯著改善了GM引起的氧化應激反應。提示青蒿琥酯可能通過激活Keap1/Nrf2信號通路抑制氧化應激來改善GM誘導犬急性腎損傷。

為了進一步驗證這一機制，本研究分別在動物水平和細胞水平進行了Keap1/Nrf2信號通路阻斷試驗。在GM誘導急性腎損傷動物模型中，發現與給予ART組比較，給予試驗犬ART同時加入Nrf2抑制劑ML385后Nrf2及其調控下游抗氧化代謝酶HO1和GCLC蛋白表達下調，腎組織抗氧化應激能力降低，T-SOD和GSH水平降低，MAD水平升高。說明抑制Nrf2表達，可降低ART對GM誘發犬急性腎損傷的保護作用。與MDCK細胞比較，在過表達Keap1和敲減Nrf2表達的MDCK細胞中，Nrf2及其下游抗氧化代謝酶HO1和GCLC表達下調，ART抗GM誘導細胞氧化應激能力也顯著減弱。說明抑制Keap1/Nrf2信號通路可減弱青蒿琥酯對MDCK細胞抗氧化能力。

4 結 論

青蒿琥酯可以通過激活Keap1/Nrf2通路，上調下游靶基因抗氧化代謝酶HO1及GCLC等分子表達，抑制氧化應激反應，在慶大霉素誘導急性腎損傷進程中具有良好的保護效應。為青蒿琥酯在臨床上防治犬急性腎損傷的應用提供科學依據。