NR1H3基因調控豬前體脂肪細胞分化的研究

2022-08-05 07:12:16史明月張雪蓮楊曉奮邢建東高鵬飛郭曉紅李步高曹果清

畜牧獸醫學報 2022年7期

史明月，張雪蓮，楊曉奮，牛瑾，邢建東，路暢，高鵬飛，郭曉紅，李步高，曹果清*

(1.山西農業大學動物科學學院，太谷 030801； 2.晉城市農業農村局現代農業發展中心，晉城 048000)

動物體脂肪的合成與沉積對于胴體品質有重要影響，脂肪組織的合成需要經過前體脂肪細胞數目、體積的增加，細胞的融合分化等過程。其中脂肪細胞的分化受到多條信號通路調控，每條通路都包含多種轉錄因子，通過各種途徑調控脂肪細胞的分化。過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferators-activated receptors, PPARs)家族、脂肪酸結合蛋白(fatty acid-binding protein, FABP)、CCAAT/增強子結合蛋白(CCAAT /enhancer binding protein, C/EBP)、類固醇調節元件結合蛋白(sterol regulatory element binding protein, SREBP)等均為公認的與脂肪形成相關的轉錄因子，其中過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptor，PPAR)是最熟知的轉錄調控因子。碳水化合物反應元件結合蛋白(carbohydrate response element binding protein，ChREBP)也是與脂肪合成相關的轉錄因子，還能調控脂肪細胞的分化，對于脂質代謝和葡萄糖轉運也有重要意義。脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，FAS)主要參與脂肪酸的合成代謝，通過調節甘油三酯的含量影響動物機體脂質的沉積。

肝X受體(liver X receptors，LXRs)屬于核受體超家族成員，受氧化型膽固醇調節，在脂質代謝中是一個不可缺少的調節因子。核受體亞家族1H成員3(nuclear receptor subfamily 1 group H member 3，NR1H3)屬于LXRs的一員，也稱肝X受體α(liver X receptor α，LXRα)，在人和多種動物組織中廣泛表達，在肝、腎中的表達量較多，主要作為膽固醇的感受器，通過調控下游基因來影響膽固醇的合成與轉化。此外，1H3在碳水化合物、脂蛋白代謝等方面也發揮重要作用。敲除1H3的小鼠血脂含量偏低，脂肪酸和甘油三酯的表達受到影響，脂肪形成能力減弱，證明1H3參與到小鼠的成脂過程，對于脂質代謝過程的穩定運轉具有重要意義。1H3在鴨原代肝細胞中過表達后，高密度脂蛋白和三酰甘油表達量增加。在脂肪肝細胞中敲低1H3后，三酰甘油含量降低，脂肪酸的合成過程受到影響。這都說明1H3對于脂質合成、脂質代謝、脂肪沉積等過程具有重要意義。

目前，有關1H3基因在脂肪細胞脂質積累中作用的研究主要集中在小鼠和山羊等物種中，其對豬脂肪細胞中脂質積累的調控作用研究較少。本研究在探究1H3基因在豬皮下脂肪組織中的發育性表達規律的基礎上，構建豬1H3過表達載體并篩選有效的豬1H3 siRNA，轉染豬前體脂肪細胞并誘導其分化，采用油紅O染色、qRT-PCR及Western blot技術檢測脂滴形成情況及成脂分化關鍵基因的表達變化，探究1H3基因對豬前體脂肪細胞分化及脂肪生成的影響，為闡明豬1H3基因的功能及作用機制奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

來源于大同市種豬場的30、90和240日齡的馬身豬各4頭，同一階段的個體按要求飼養，達到目標日齡時屠宰，采集背部脂肪組織，用于1H3基因發育性表達規律研究。5日齡杜長大仔豬(公)來源于山西省天祿豐種豬育種有限公司，屠宰后采集背部脂肪組織，分離培養豬前體脂肪細胞。本研究的試驗設計經過山西農業大學動物倫理委員會批準后實施。

1.2 主要試劑與載體

Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser、RNAiso Plus regent和SYBR Premix Ex Taq II購于大連TaKaRa公司；Insulin和羅格列酮購自Sigma公司；I型膠原酶、DEX、IBMX、PBS粉末、青鏈霉素混合液、胰蛋白酶和油紅O染液購于中國索萊寶公司；FBS和DMEM購自Gibco公司；Adiponectin抗體、NR1H3抗體、β-actin抗體購于博奧森公司；兔二抗購于LI-COR；轉染試劑Lipofecter 3000、過表達載體pIRES2-EGFP-3×flag購自漢恒生物科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 總RNA提取、反轉錄及qRT-PCR檢測參照TaKaRa RNAiso Plus和試劑盒說明書提取脂肪組織和細胞總RNA，按照 PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒說明書進行反轉錄，合成的cDNA于-20 ℃保存備用。

以18為內參基因，采用qRT-PCR對1H3及相關標志基因的表達水平進行檢測，引物信息見表1。qRT-PCR反應體系：cDNA 2 μL，2×SYBR Premix Ex TaqⅡ10 μL，上、下游引物各0.5 μL，RNAase Free ddHO補至20 μL。反應程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，58 ℃ 30 s，35個循環；熔解曲線程序為95 ℃ 15 s，60 ℃ 35 s，95 ℃。結果采用2法進行分析，每個樣本做3次技術重復。

表1 qRT-PCR引物信息Table 1 Primer information of qRT-PCR

1.3.2 豬前體脂肪細胞的分離、鑒定與誘導分化 5日齡杜長大仔豬放血處死后用75%酒精消毒，取背部皮下脂肪組織，用含2%青鏈霉素的PBS清洗3次后移入超凈工作臺；去除筋膜及結締組織，置于小燒杯中剪成肉糜狀；加入等體積Ⅰ型膠原酶消化液(2 mg·mL)，37 ℃消化30 min；加入等體積終止培養基(3% FBS+DMEM)終止消化；依次用70、200目的篩子過濾，1 100 r·min離心5 min，獲得細胞沉淀；完全培養基重懸沉淀，加入10 cm培養皿中，于CO恒溫培養箱中培養。

采用細胞免疫熒光法檢測脂肪細胞因子Adiponectin含量以鑒定細胞的純度。細胞密度達70%～80%時，棄掉培養基，PBS洗3次；4%多聚甲醛固定40 min；0.1%的Triton-100通透10 min，PBS洗3次；5% BSA封閉60 min，每孔加入100 μL Adiponectin鼠一抗(1∶100)，室溫孵育6 h，PBS洗3次；加入適量FITC標記的熒光二抗(1∶100)，覆蓋孔板底部，37 ℃孵育2 h，PBS洗3次；加入100 μL DAPI染液，避光染色10～15 min，PBS清洗數次；熒光顯微鏡下觀察并拍照。

前體脂肪細胞成脂分化的誘導采用“激素雞尾酒”法。待細胞長滿后，更換誘導分化培養基(DMEM+10% FBS+5 μg·mLInsulin+0.5 mmoL·LIBMX+1 μmoL·LDEX+1 gmoL·L羅格列酮+1%青鏈霉素)，培養2 d更換維持培養基(DMEM +10% FBS+1%青鏈霉素+5 μg·mL胰島素)，培養8 d后收集細胞，期間2 d換1次液。

1.3.31H3基因過表達載體的構建、轉染及相關標志基因的檢測以實驗室前期獲得的豬1H3基因菌液為模板，利用同源重組引物(F:CTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCGCCACC-ATGTCCTTGTGGGTGGAGG；R:CACCGTCA-TGGTCTTTGTAGTCCATCTCGTGCACATCC-CAGATCTCAG)擴增含有過表達載體同源臂的目的片段，將目的基因片段通過同源重組連接到過表達載體pIRES2-EGFP-3×Flag上，構建1H3基因過表達載體。

試驗設置過表達組和對照組，過表達組添加1H3-OE，對照組添加1H3-NC。當豬前體脂肪細胞生長至70%～80%時進行轉染。分別將轉染試劑和載體加入到無血清的DMEM中，室溫靜置5 min后將兩者混合，靜置20 min，進行轉染。轉染48 h后，誘導分化，8 d后收集細胞，檢測1H3過表達效率及下游靶基因-1c和及成脂關鍵基因、、4和的表達量變化。

1.3.4 豬1H3 siRNA的合成、轉染及相關標志基因的檢測根據NCBI上豬1H3的基因序列(登錄號：NM_001101814.1)，選擇不同位點設計3對1H3 siRNA，命名為siRNA-1、siRNA-2和siRNA-3，對照組為siRNA-NC，由漢恒生物公司合成(表2)。

表2 NR1H3 siRNA序列信息Table 2 Sequence information of NR1H3 siRNA

采用脂質體法分別將siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3 和siRNA-NC轉染入豬前體脂肪細胞，48 h 后收集細胞，檢測1H3基因的表達量，篩選干擾效果最佳的siRNA進行后續試驗。在豬前體脂肪細胞中分別轉染siRNA-NC和siRNA-2，誘導分化10 d后收集細胞，檢測1H3下游靶基因-1c和及成脂關鍵基因、、4和的表達情況。

1.3.5 Western blot檢測成脂關鍵基因的表達細胞成脂分化10 d后，收集蛋白質樣品，100 ℃變性10 min；制備分離膠和濃縮膠進行SDS-PAGE，電泳條件為90 V 15 min，120 V 60 min，保持恒壓進行；5%奶粉封閉1 h；加入一抗(1∶1 000)4 ℃過夜；洗滌3次，加入二抗(1∶10 000)，避光孵育1 h；洗滌后觀察蛋白條帶，分析灰度值。

1.3.6 細胞油紅O染色細胞成脂分化第10天，PBS漂洗3次，4%的多聚甲醛37 ℃固定30 min；PBS漂洗3次，加入油紅O染液37 ℃染色60 min；PBS漂洗5次，在光學顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.7 統計分析應用SPSS version 22.0進行統計分析。采用單因素方差分析探討馬身豬不同日齡背部皮下脂肪組織中1H3基因表達量的差異，采用Duncan’s法進行多重比較；試驗組與對照組相關基因及蛋白質表達量之間的差異采用獨立樣本檢驗進行比較；<0.05為差異顯著，<0.01為差異極顯著。

2 結果

2.1 NR1H3基因在豬皮下脂肪組織中的發育性表達特性

馬身豬皮下脂肪組織1H3基因表達量隨日齡增加呈逐漸升高的趨勢，240日齡表達量最高，30日齡表達量最低，差異極顯著(<0.01，圖1)，表明其對脂肪沉積可能發揮促進作用。

不同大寫字母代表差異極顯著(P<0.01)Different capital letters represent the extremely significant difference (P<0.01)圖1 不同日齡馬身豬皮下脂肪組織中NR1H3的相對表達量Fig.1 Relative expression of NR1H3 in subcutaneous adipose tissues of Mashen pigs at different ages

2.2 豬前體脂肪細胞的分離及其純度鑒定

分離的豬前體脂肪細胞形態為圓形、橢圓形、梭形等不規則形狀，6 d左右匯合度達到70%～80%(圖2A)。誘導分化后，前體脂肪細胞膨大變形，出現脂滴。隨著細胞密度不斷增加，脂滴逐漸增多，相鄰的小脂滴發生融合(圖2B)。

A. 豬前體脂肪細胞；B. 成脂誘導的豬前體脂肪細胞；C～E. Adiponectin標記的豬前體脂肪細胞純度鑒定A. Porcine preadipocytes； B. Adipogenic induction of porcine preadipocytes; C-E. Purity identification of porcine preadipocytes marked by Adiponectin圖2 豬前體脂肪細胞的分離與純度鑒定Fig.2 Isolation and purity identification of porcine preadipocytes

免疫熒光染色檢測Adiponectin的表達情況，發現綠色熒光均勻分布于胞漿(圖2C)，細胞核藍染(圖2D)，99%以上的細胞帶有綠色熒光，為陽性結果(圖2E)。因此，可鑒定所培養的細胞為豬前體脂肪細胞，純度在99%以上。

2.3 過表達NR1H3基因促進豬前體脂肪細胞的成脂分化

細胞培養到70%～80%融合時，將1H3-NC和1H3-OE轉染入豬前體脂肪細胞，48 h后，顯微鏡觀察GFP的表達情況，1H3-NC組和1H3-OE組的綠色熒光達到80%，轉染效率相似(圖3A、3B)。qRT-PCR和Western blot檢測結果顯示，與1H3-NC組相比，1H3-OE組1H3的mRNA表達水平上升7.63倍(<0.01，圖3C)，蛋白表達水平上升1.83倍(<0.01，圖3D、3E)，表明過表達成功。

A、B. 轉染NR1H3-NC和NR1H3-OE的豬前體脂肪細胞；C. NR1H3基因mRNA表達量；D、E. NR1H3蛋白表達量。**.P<0.01，下同A, B. Porcine preadipocytes transfected with NR1H3-NC and NR1H3-OE; C. The mRNA expression of NR1H3 gene; D, E. NR1H3 protein expression level.**. P<0.01, the same as below圖3 NR1H3基因在豬前體脂肪細胞中的過表達效率Fig.3 The over-expression efficiency of NR1H3 gene in porcine preadipocytes

將轉染1H3-NC和1H3-OE的豬前體脂肪細胞誘導分化后進行油紅O染色，結果顯示，與1H3-NC組相比，1H3-OE組的油紅O染色著色深(圖4A、4B、4C)；用酶標儀測定細胞的OD值，結果同樣存在極顯著差異(<0.01，圖4D)；1H3-OE組成脂分化關鍵基因、、和4及1H3基因下游靶標-1c和的mRNA水平均極顯著升高(<0.01，圖4E)。綜上結果表明，過表達豬1H3基因促進豬前體脂肪細胞的分化。

A. 油紅O染色結果；B、C. 細胞油紅O染色；D. NR1H3-NC和NR1H3-OE組 OD450 nm值；E. NR1H3-NC和NR1H3-OE組NR1H3及成脂關鍵基因mRNA表達量A. Oil red O staining results; B，C. Oil red O staining of cells; D. The OD value at 450 nm in NR1H3-NC and NR1H3-OE groups; E. The mRNA expression of NR1H3 and the key adipogenic genes in NR1H3-NC and NR1H3-OE groups圖4 過表達NR1H3對豬前體脂肪細胞分化的影響Fig.4 The effect of NR1H3 over-expression on differentiation of porcine preadipocytes

2.4 干擾NR1H3基因抑制豬前體脂肪細胞的成脂分化

與siRNA-NC組相比，siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3 組中1H3基因mRNA表達水平分別降低了71.9%、78.0%和42.3%(<0.01，圖5A)，siRNA-2 干擾效果最佳，用于后續試驗。Western blot結果顯示，與siRNA-NC組相比，siRNA-2組NR1H3表達水平下調了23.5%(<0.01，圖5B、5C)，表明干擾成功。

A. 不同NR1H3 siRNA組別NR1H3基因mRNA表達量；B～C. siRNA-NC和siRNA-2組NR1H3蛋白表達量A. The NR1H3 mRNA expressions in different NR1H3 siRNA groups; B-C. The NR1H3 protein expressions in NR1H3 siRNA-NC and siRNA-2 groups圖5 NR1H3干擾效率的檢測Fig.5 NR1H3 interference efficiency detection

將轉染入干擾載體的豬前體脂肪細胞誘導分化后進行油紅O染色，通過肉眼和倒置顯微鏡同樣明顯觀察到油紅O著色差異(圖6A、6B、6C、6D)；用酶標儀測定細胞的OD值，也存在極顯著差異(<0.01，圖6E)；與siRNA-NC組相比，siRNA-2組的1H3基因下游靶標-1c和及成脂分化關鍵基因、、和4的mRNA水平均極顯著降低(<0.01，圖6F)。綜上結果表明，干擾豬1H3基因抑制豬前體脂肪細胞的分化。

A、B. 油紅O染色結果；C、D. 細胞油紅O染色; E. siRNA-NC組和siRNA-2組OD 450 nm值；F. siRNA-NC組和siRNA-2 組成脂關鍵基因mRNA表達量A, B. Oil red O staining results; C, D. Oil red O staining of cells; E. The OD values at 450 nm in siRNA-NC and siRNA-2 groups; F. The mRNA expression of key adipogenic genes in siRNA-NC and siRNA-2 groups圖6 干擾NR1H3基因對豬前體脂肪細胞分化的影響Fig.6 The effect of NR1H3 siRNA on differentiation of porcine preadipocytes

3 討論

脂肪的含量與分布會影響胴體品質和肉的風味。脂肪的形成主要依賴脂肪細胞的增殖、分化，之后，三酰甘油不斷沉積，而成脂相關轉錄因子在脂質沉積過程中發揮著關鍵調控作用。1H3是近年來在脂肪生成過程中發揮關鍵作用的轉錄因子，與多種脂肪酸合成酶的表達相關。研究發現，1H3小鼠下調了-1c和重要的脂肪形成酶、-1和表達水平，導致小鼠的脂肪生成減弱。敲低1H3抑制了山羊肌內前體脂肪細胞分化。經過LXR激動劑處理可能增加脂肪細胞中甘油三酯的含量及脂質蓄積。此外，1H3在乳腺脂質合成過程中也發揮作用。研究發現，1H3可以通過直接與啟動子相互作用，影響-1的表達，從而促進乳脂合成；也可作用于-1c，然后影響的表達，調控脂肪酸的生成。

本研究中，過表達1H3后，-1c和的表達量顯著上調(<0.01)，脂肪生成標記基因、和4的表達量同樣極顯著上升(<0.01)，脂滴形成增加；干擾1H3則呈現相反趨勢，表明1H3在豬前體脂肪細胞的分化過程中具有促進作用，進而促進成脂過程。研究表明，-1c是1H3的關鍵靶標，參與調控脂肪酸生成相關酶的表達，進而調控脂肪細胞分化。顯著影響成脂相關基因和1的表達量，是脂肪組織必需的調控因子，1H3可激活的轉錄，從而激活脂肪形成基因，促進脂肪細胞分化。可見，1H3通過調控其下游靶標-1c和的表達水平影響成脂關鍵基因、和4的表達，進而影響豬前體脂肪細胞的分化，是豬前體脂肪細胞成脂分化的正調節劑。

盡管1H3在多個物種中都有研究，但其對于脂肪細胞分化的作用并不統一，可能是脂肪細胞分化正反兩方面的調節器。Ross等報道，LXR活性抑制原代前體脂肪細胞的分化和脂質蓄積。1H3通過Wnt /β-catenin信號傳導對鼠間充質干細胞(MSCs)的成脂分化具有抑制作用。這些不一致的結果可能反映了物種、細胞類型和培養條件等的差異。

1H3基因近年來受到廣泛的關注，已在小鼠和山羊等物種中證實與脂肪細胞脂質積累相關，但在豬脂肪沉積中的作用鮮有報道。Zhang等研究發現，1H3-exon-5-A201C的C等位基因與背膘厚度有關，可能促進豬的脂質沉積，并增加皮下脂肪和肌內脂肪含量，推斷與高脂質沉積有關。本研究中，細胞試驗結果表明1H3是豬前體脂肪細胞成脂分化的正調節劑，而且1H3基因在馬身豬皮下脂肪組織的表達量隨著日齡的增長極顯著上升，與豬脂肪沉積的趨勢一致，表明該基因在調控豬脂肪代謝過程中可能發揮重要作用。