苦參堿對昆明小鼠糞便及血漿代謝物的影響

孫 娜，曹志剛，張 華，王 弘，孫盼盼，孫耀貴，范闊海，尹 偉，李宏全*

(1. 中獸醫藥現代化山西省重點實驗室 山西農業大學動物醫學學院，太原 030000；2. 山西農業大學體育部，太原 030000； 3. 山西農業大學實驗動物管理中心，太原 030000)

在“飼料禁抗、養殖減抗”的大背景下，尋找抗生素的替代品成為了研究的熱點。苦參堿是從苦參中提取的一種生物堿，具有抗炎、抗氧化和抗腫瘤等多種藥理作用。實驗室前期研究發現，苦參堿具有抗豬心肌炎、豬圓環病毒II型、豬繁殖與呼吸綜合征等病毒的作用。有研究證明，苦參堿在治療新型冠狀病毒肺炎方面，也具有較好的臨床效果。實驗室前期研究發現，苦參堿亦可調節昆明小鼠腸道菌群結構，增加益生菌嗜酸乳桿菌在腸道菌群的豐度及在各段腸道的定植。

非靶向代謝組學是通過定性和相對定量生物體系中的代謝物，最大程度反映總的代謝物信息，從而揭示組間代謝物的差異。利用非靶向血液代謝組學，發現了與糖尿病發生發展密切相關的代謝通路，并詮釋了銀杏葉提取物干預糖尿病大鼠的作用機制。非靶向代謝組學技術與16S rDNA高通量測序技術聯合分析，可以將差異菌群與差異代謝物聯系起來，進一步闡明疾病或者藥物對機體產生影響的機理。Wu等通過16S rDNA腸道菌群測序聯合非靶代謝組學技術揭示了中藥活性成分大黃酸治療潰瘍性結腸炎的機制；Yang等使用微生物組與代謝組技術系統揭示了結直腸癌中的腸道菌群與代謝組之間的關系，為直腸癌的診斷與治療提供了理論依據。

苦參堿具有多種藥理作用，且具有臨床應用價值。但苦參堿在體內的代謝情況如何？是否和其藥理作用有關？苦參堿對腸道菌群的調節與苦參堿在體內的代謝有什么關系？為了闡釋以上問題，本研究利用非靶向代謝組學分析苦參堿對昆明小鼠糞便和血漿代謝物的影響，并通過16S rDNA測序與代謝組學聯合分析，探究苦參堿藥理作用發揮的可能機理，解析苦參堿在體內的代謝情況。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

清潔級昆明小鼠，雌性，18～22 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司；苦參堿購自南京澤朗生物科技有限公司，其純度為98.7%。

1.2 試驗設計

將20只昆明小鼠隨機分為兩組，每組10只，分別是苦參堿處理組(MT)和生理鹽水處理組(NC)。適應性飼養1周后，按照每10 g體重0.2 mL劑量，腹腔注射40 mg·kg的苦參堿，連續給藥5 d，每日2次，生理鹽水組等體積腹腔注射生理鹽水。給藥第6天，收集各組小鼠糞便及血漿，進行非靶向代謝組學分析，并通過此前的16S rDNA測序結果與代謝組學聯合分析，探究菌群與代謝物之間的相互關系。

1.3 小鼠糞便收集與樣品處理

給藥第6天，對小鼠腹部按摩，促使其排便，迅速將糞便收集至無菌管中，液氮速凍后-80 ℃保存。-80 ℃取出樣品，稱量60 mg，分別加入200 μL水勻漿后渦旋60 s，加入800 μL甲醇乙腈溶液(1∶1，)，渦旋60 s，低溫超聲30 min，重復2次，-20 ℃放置1 h沉淀蛋白，14 000×，4 ℃離心20 min，取上清進樣。

1.4 小鼠血漿收集與樣品處理

給藥第6天，通過眼球采血，收集全血于肝素抗凝管中，上下輕輕顛倒混勻后，室溫靜置30 min，2 000×離心10 min分離得到上層血漿樣本，隨后將血漿轉移至1.5 mL離心管中，液氮速凍后，-80 ℃ 保存。-80 ℃取出樣品，4 ℃緩慢溶解后分別取各組樣品100 μL，加入400 μL預冷的甲醇乙腈溶液(1∶1，)，渦旋60 s，-20 ℃放置1 h沉淀蛋白，14 000×，4 ℃離心20 min，取上清進樣。

1.5 色譜-質譜分析

色譜條件：樣品采用Agilent 1290 Infinity LC超高效液相色譜系統(HILIC)色譜柱進行分離；柱溫25 ℃； 流速0.3 mL·min；流動相組成A：水+25 mmol·L乙酸銨+25 mmol·L氨水，B：乙腈；梯度洗脫程序如下：0～0.5 min，95% B；0.5～7 min， B從95%線性變化至65%；7～8 min，B從65%線性變化至40%；8～9 min，B維持在40%；9～9.1 min， B從40%線性變化至95%；9.1～12 min， B維持在95%；整個分析過程中樣品置于4 ℃ 自動進樣器中。為避免儀器檢測信號波動而造成的影響，采用隨機順序進行樣本的連續分析。樣本隊列中插入QC樣品，用于監測和評價系統的穩定性及試驗數據的可靠性。

質譜條件：采用AB Triple TOF 6600質譜儀采集樣品的一級、二級譜圖。分別采用電噴霧電離(ESI)正離子和負離子模式進行檢測。ESI源設置參數如下：霧化氣輔助加熱氣(Gas1)：60，輔助加熱氣2(Gas1)：60，氣簾氣(CUR)30 psi，離子源溫度600 ℃，噴霧氣壓(ISVF)±5500 V(正負兩種模式)；一級質荷比檢測范圍：60～1 000 u，二級子離子質荷比檢測范圍：25～1 000 u，一級質譜掃描累計時間：0.2 s/spectra，二級質譜掃描累計時間0.05 s/spectra。二級質譜采用數據依賴型采集模式(IDA)獲得，并且采用峰強度值篩選模式，去簇電壓(DP)：±60 V(正負兩種模式)，碰撞能：35±15 eV。IDA設置如下：動態排除同位素離子范圍：4 u，每次掃描采集10個碎片圖譜。

1.6 差異菌群與差異代謝物的相關性分析

課題組前期通過16S rDNA高通量測序技術，從苦參堿作用后的昆明小鼠糞便中篩選出顯著性差異菌種嗜酸乳桿菌，利用Spearman統計方法分析顯著性差異的菌群與顯著性差異的代謝物之間的相關系數，通過R語言和Cytoscape軟件進行層次聚類、相關性網絡分析。

1.7 數據分析

原始數據經ProteoWizard轉換成mzXML格式，然后采用XCMS程序進行峰對齊、保留時間校正和提取峰面積。數據經Pareto-scaling預處理后，進行多維統計分析，試驗結果以FC>1.5、<0.05、VIP>1時表示為差異顯著。

2 結 果

2.1 糞便及血漿差異代謝物的篩選

圖1為糞便及血漿代謝物中正、負離子模式數據的火山圖，圖中紅色點為篩選的差異代謝物(FC>1.5，<0.05)，結果表明在苦參堿作用下，糞便及血漿中的代謝物均存在差異。采用正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)進行組間差異分析，在OPLS-DA得分圖上，橫坐標t1為預測主成分，主要反映組間差異；縱坐標為正交主成分，主要反映組內差異。圖2直觀顯示了糞便及血漿正、負離子模式下代謝物之間的差異，圖中苦參堿組樣品與生理鹽水組樣品分別聚為兩簇，表明在苦參堿作用下糞便及血漿中存在特異性的代謝組。選擇OPLS-DA模型得到的變量權重值VIP(variable importance for the projection)>1，同時<0.05作為顯著差異代謝物。糞便顯著差異代謝物如表1所示，糞便中共鑒定出L-精氨酸(L-arginine)、組胺(histamine)、羥喹啉(oxyquinoline)、水楊酸(salicylic acid)等97種顯著差異代謝物；血漿顯著差異代謝物如表2所示，血漿中共鑒定出牛磺膽酸鹽(taurocholate)、黃豆苷元(daidzein)、酪胺(tyramine)等44種顯著差異代謝物。

表1 糞便差異代謝物鑒定表Table 1 Identification table of significantly differential metabolites in feces

(續表1 Continued)

(續表1 Continued)

表2 血漿差異代謝物鑒定表Table 2 Identification table of significantly differential metabolites in plasma

(續表2 Continued)

圖1 糞便正(A)、負(B)離子模式及血漿正(C)、負(D)離子模式下火山圖Fig.1 Volcano plots in positive (A), negative (B) ion modes of feces and positive (C), negative (D) ion modes of plasma

圖2 糞便正(A)、負(B)離子模式及血漿正(C)、負(D)離子模式下OPLS-DA得分圖Fig.2 OPLS-DA score charts in positive (A), negative (B) ion modes of feces and positive (C), negative (D) ion modes of plasma

2.2 差異代謝物的聚類分析

分別將從糞便及血漿中篩選出來的正(圖3)、負(圖4)離子模式下的差異代謝物進行聚類分析，結果顯示，糞便中共鑒定出苦參堿組有35種代謝物上調，分別為Vitamin E、L-Palmitoylcarnitine等脂質和類脂質分子，Deoxyadenosine、Deoxyinosine等核苷、核苷酸和類似物，Purine、Cytosine、Thymine及Isoetharine、Indole-2-carboxylic acidl、Quadrone、L-Glutamine等雜環化合物。苦參堿組中下調了104種代謝物，分別為L-Proline、L-Arginine、L-Phenylalanine、L-Methionine、L-Citrulline、Arg-Thr、Pro-Ala、Phe-Ser等氨基酸和二肽，N-Acetylmannosamine、Maltotriose、Stachyose、L-Arabinose等有機氧化物，Taurocholate、Taurodeoxycholic acid等脂質和類脂質分子。

圖3 正離子模式下糞便差異代謝物聚類分析結果Fig.3 Hierarchical clustering results of differential fecal metabolites in positive ion mode

圖4 負離子模式下糞便差異代謝物聚類分析結果Fig.4 Hierarchical clustering results of different fecal metabolites in negative ion mode

血漿正(圖5)、負(圖6)離子模式下差異代謝物聚類分析結果顯示，血漿中共鑒定出苦參堿組上調了20種代謝物，分別是Dimethylglycine、Succinate、cis-Aconitate、DL-lactate等羧酸及其衍生物，1-Methylnicotinamide、Allantoin、4-Pyridoxic acid等有機雜環化合物，Citramalic acid、Cholic acid等脂質和類脂質分子。苦參堿組下調了35種代謝物，分別是Daidzein、Genistein等苯丙烷和聚酮化合物，Tyramine、Salicylic acid等苯甲酸鹽，Diethanolamine、Phosphorylcholine等有機氮化合物，D-Proline、L-Methionine、L-Arginine、L-Citrulline等氨基酸、肽和類似物，Indole-3-pyruvic acid、L-Tryptophan等有機雜環化合物，Taurocholate、Taurochenodeoxycholate、Arachidonic Acid(peroxide free)等脂質和類脂質分子。

圖5 正離子模式下血漿差異代謝物聚類分析結果Fig.5 Hierarchical clustering results of differential plasma metabolites in positive ion mode

圖6 負離子模式下血漿差異代謝物聚類分析結果Fig.6 Hierarchical clustering results of differential plasma metabolites in negative ion mode

2.3 糞便及血漿差異代謝物KEGG通路分析

通過KEGG通路分析發現，糞便及血漿差異代謝物分別被映射到Protein digestion and absorption、Central carbon metabolism in cancer、Aminoacyl-tRNA biosynthesis、Mineral absorption、Arginine and proline metabolism等KEGG代謝途徑。經比對分析發現苦參堿處理組糞便(圖7A)及血漿(圖7B)中Protein digestion and absorption、ABC transporters、Central carbon metabolism in cancer，Aminoacyl-tRNA biosynthesis和Mineral absorption等重要通路發生了顯著變化。

圖7 糞便(A)和血漿(B)差異代謝物的KEGG通路分析結果Fig.7 The results of KEGG pathway analysis of the differential metabolites of feces (A) and plasma (B)

2.4 糞便與血漿差異代謝物關聯分析

血漿差異代謝物中L-Ascorbic acid、Dimethylglycine、Allantoin、1-Methylhistidine、L-Glutamine、DL-lactate、Phenylacetylglycine、Succinate、D-Mannose等代謝物與糞便差異代謝物中Desoxypeganine、Quadrone、Purine、Adenine、alpha-Tocopherol (Vitamin E)、Cytosine、L-Palmitoylcarnitine、Ramipril、DL-3-Phenyllactic acid、Thymine等代謝物呈正相關，與糞便差異代謝物中Atrolactic acid、Phenyllactic acid、Guanosine、Tyramine、L-Phenylalanine、Daidzein、Betaine、Oxyquinoline、Dopamine等呈負相關；血漿差異代謝物中Indole-3-pyruvic acid、Trans-4-Hydroxy-L-proline、3-Indoleacetonitrile、L-Methionine、L-Arginine、D-Proline、Oxyquinoline、Phosphorylcholine等代謝物與糞便代謝物中L-Arginine、L-Citrulline、Ser-Arg、Histamine、L-Pyroglutamic acid、DL-Methionine sulfoxide、Atrolactic acid、Phenyllactic acid、Guanosine等呈正相關，與糞便差異代謝物中Desoxypeganine、Indole-2-carboxylic acid、Isoetharine、N-Acetylmannosamine、Purine、Adenine、alpha-Tocopherol (Vitamin E)、Cytosine、L-Palmitoylcarnitine、Thymine、Enterostatin human等代謝物呈負相關，以上結果表明血漿代謝物與糞便代謝物之間存在相關性(圖8)。

圖8 糞便差異代謝物與血漿差異代謝物相關性分析Fig.8 Correlation analysis of different metabolites in feces and plasma

2.5 差異代謝物與腸道菌群關聯分析

將經過16S rDNA測序分析得到的顯著差異菌種嗜酸乳桿菌()(LDA>4，<0.05)分別與糞便(圖9A)、血漿(圖9B)顯著性差異代謝物(VIP>1，<0.05)進行關聯分析。圖中圓圈代表顯著性差異的菌屬，矩形代表顯著性差異的代謝物。藍色線條代表負相關，紅色線條代表正相關，線條的粗細與相關系數的絕對值成正比。結果顯示嗜酸乳桿菌與糞便中Ile-Arg、Val-Glu、Thr-Lys等二肽、羧酸及其衍生物呈負相關，與Phe-Ile、Isoetharine、Purine等呈正相關(圖9A)；與血漿中D-Proline、L-Citrulline、L-Arginine、L-Valine、L-Methionine、Arg-Glu等二肽、氨基酸及5(S)-HpETE、Genistein、Taurochenodeoxycholate等呈負相關，與1-Methylnicotinamide、DL-lactate、Succinate、Dimethylglycine、Phenylacetylglycine等呈正相關(圖9B)，以上結果表明糞便及血漿代謝物與腸道菌群嗜酸乳桿菌存在相關性。

圖9 糞便(A)、血漿(B)顯著差異代謝物與嗜酸乳桿菌的Spearman相關分析Fig.9 Spearman correlation analysis of significant differential metabolites in feces (A), plasma (B) with Lactobacillus acidophilus

3 討 論

現代研究已證實，苦參堿具有抗炎、抗癌、抗病毒等多種藥理作用，而發揮這些藥理作用的機制尚未闡釋清楚。本試驗通過非靶向代謝組學，分別檢測了腹腔注射苦參堿后昆明小鼠糞便和血漿的代謝產物。結果顯示，苦參堿對昆明小鼠的體內代謝造成了影響，在糞便和血漿中均存在顯著差異代謝物。其中，二甲基甘氨酸(Dimethylglycine)、尿囊素(Allantoin)、L-谷氨酰胺(L-Glutamine)、L-抗壞血酸(L-Ascorbic acid)、維生素E(Vitamin E)、檸檬酸(Citramalic acid)等含量增多。研究表明，二甲基甘氨酸、二甲基甘氨酸鈉鹽在抗氧化及自由基清除方面有重要價值。尿囊素對卵白蛋白(OVA)誘導的肺部炎癥具有保護作用，可以減輕因哮喘而導致的氣道炎癥細胞浸潤。谷氨酰胺可減輕細胞凋亡，提高機體總抗氧化能力，發揮有效的抗氧化和抗炎作用，還可以增強腸道固有免疫力，抑制腸毒素性大腸桿菌的感染。L-抗壞血酸在許多酶反應中起輔助因子的作用。檸檬酸在提高抗病能力及成活率，調節免疫細胞功能等方面有重要意義。維生素E在抗炎、抗氧化等方面具有重要的作用。膽酸可以顯著抑制CVB3病毒感染HeLa細胞。這些研究結果表明，苦參堿藥理作用的發揮可能與以上代謝產物有關，其深入的調控機制仍需進一步研究。

在對苦參堿差異代謝物分析時，發現在血漿的代謝產物中有苦參堿的存在，但糞便代謝產物中并未檢測到苦參堿。在糞便與血漿差異代謝物關聯分析時，發現血漿中苦參堿與糞便中脫氧鴨嘴花堿(Desoxypeganine)呈正相關。脫氧鴨嘴花堿是一種吡咯[2,1-b]并喹唑啉類生物堿，具有抗炎、抗氧化應激和調節神經遞質等藥理作用。苦參堿藥理作用的發揮是否與脫氧鴨嘴花堿有關，仍需設計試驗進一步探究。研究表明，腸道菌群與中藥活性成分的互作，在發揮中藥療效中有重要作用。結合差異代謝物與嗜酸乳桿菌的關聯分析，還發現糞便中嗜酸乳桿菌的含量與脫氧鴨嘴花堿呈正相關。因此推測，苦參堿通過腹腔注射進入腹腔后，經過腹膜血管、淋巴和肝吸收入血，引起血漿代謝物的改變，苦參堿入血后經過肝代謝轉化，代謝物進入腸道，與腸道菌群互作，在調節腸道菌群的同時，被菌群進一步代謝，從而引起糞便代謝物的變化。

綜上，苦參堿可調節昆明小鼠的體內代謝，在糞便和血漿中均存在顯著差異代謝物。這些差異代謝物之間以及與腸道菌群間存在相關性。苦參堿的體內差異代謝物及與菌群之間的互作可能是其發揮藥理作用的關鍵。

4 結 論

腹腔注射苦參堿可以調節昆明小鼠的體內代謝，在糞便和血漿中均存在顯著差異代謝物。苦參堿的體內差異代謝物及與腸道菌群之間的互作可能是其發揮藥理作用的關鍵。本試驗為苦參堿發揮抗病毒等藥理作用的機制研究奠定了數據基礎。