基于智能手機快速檢測豬肉中抗生素殘留

李周敏，王志盛，王澤昊，許俊哲，胡粲，谷苗苗

南京大學金陵學院（南京 210089）

喹諾酮類（4-quinolones，QNs）和磺胺類藥物（sulfonamides，SAs）是目前廣泛使用的合成類抗生素，主要用于預防和治療細菌性感染疾病。長期不合理使用抗生素會使細菌產生一定的耐藥性，從而降低治療效果，同時也會通過食物鏈進入人體并對健康造成潛在的危害。因此，國際食品法典委員會、美國、歐盟、日本等相繼規定了動物源性食品中最大允許殘留限量（MRLs）。2002年，我國也規定豬肉組織中磺胺類藥物的MRLs值為100 μg/kg，豬肉組織中的達氟沙星、恩諾沙星的MRLs值均為100 μg/kg，雙氟沙星為4 000 μg/kg，沙拉沙星在雞/火雞肌肉中的MRLs值為10 μg/kg。2016年，農業農村部（原農業部）發布的第2292號公告[1]中禁止將洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星4種喹諾酮類抗生素藥物用于食品動物。

國內外對于喹諾酮類、磺胺類殘留藥物有多種檢測方法，較為常見的方法有微生物法[2]、色譜法[3-8]、免疫分析法[9-12]。微生物法操作簡單、成本低，但是檢測時間長，需要對微生物進行培養、特異性差，因此目前已較少使用微生物法。色譜法具有較強的專屬性和較高的靈敏度，但是各類色譜儀價格昂貴，同時對于操作人員的技術要求較高，并且色譜法只適用于小規模樣品量的檢測。免疫分析法是根據抗原或半抗原和抗體發生特異性的免疫反應進行檢測分析，免疫分析法中酶聯免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）和膠體金試紙條技術作為快速方便、成本低廉、高通量的篩選方法，應用于眾多領域，但是ELISA只能檢測單組分殘留，而膠體金試紙條技術則無法準確定量，且容易出現假陽性等缺陷。

相比于傳統的ELISA，蛋白芯片法具有高通量、高靈敏度、簡單快速，且可同時進行多組分殘留定量檢測的特點。如今，智能手機技術發展得越來越成熟，功能越來越齊全，在數據收集和數據處理方面也十分突出，其所具備的功能也為食品藥品檢測提供了新的思路。智能手機可以使用集成傳感器直接測量物理量，可安裝各種應用程序或與其他設備進行無線連接，交互數據，同時其操作簡單、容易上手使用。智能手機相較于傳統的實驗室分析設備更輕便，易于攜帶，更容易獲得且成本更低廉，人們可利用智能手機其自身的優勢實現食品藥品的分析檢測目的。因此，將Li等[13-14]建立的基于可視化蛋白芯片的檢測方法與智能手機相結合起來，開發出一套更為簡便的檢測方法。

1 試驗材料

1.1 藥品與試劑

碳二亞胺（EDC）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、4-氨基苯甲酸甲酯（PBPA）、對乙酰氨基苯磺酰氯（ASC）、無水吡啶、 鹽酸（HCl）、乙酸乙酯、氫氧化鈉（NaOH）、無水碳酸鈉（Na2CO3）、乙腈、氯化鈉（NaCl）、氯化鉀（KCl）、磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）、磷酸二氫鉀（KH2PO4）、二甲基亞砜（DMSO）、吐溫20（Tween 20）：分析純，南京化學試劑有限公司；諾氟沙星標準品（NFLX）、納米標記喹諾酮抗體、納米標記磺胺抗體、納米銀增強顯色液（顯色液A和顯色液B）：南京祥中生物科技有限公司；牛血清白蛋白（BSA）、磺胺二甲嘧啶標準品：Sigma公司。

試驗所用的水均為18.25 MΩ·cm-1的超純水，由易普易達實驗室超純水機產生。豬肉肉樣購于當地市場。

1.2 儀器與設備

京制00000246號電子天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；EPED-10TH易普易達實驗室超純水機（南京易普易達科技發展有限公司）；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（予華儀器）；DF-I集熱式磁力攪拌器（天竟實驗儀器廠）；WKB-100微孔板恒溫震蕩儀（上海凈信實業發展有限公司）；MD200-2氮吹儀（杭州奧義儀器有限公司）；TGL-16G高速離心機（上海安亭科學儀器廠）；HH-4數顯恒溫水浴鍋（杰瑞爾電器有限公司）；MX-S旋渦混合器[大龍興創實驗儀器（北京）股份公司]；0.1～2.5，1～50，20～200和100～1 000 μL移液槍（芬蘭百德）；96孔型微孔板（南京祥中生物科技有限公司）、iPhone8智能手機（蘋果公司）；自制暗盒。

1.2.1 暗盒的制作

暗盒由六塊定制裁切的亞克力板、一塊柔光板、一塊微孔樣品放置板、兩塊放置定位板、四個定位板、兩塊限位板、一個USB電源、一個LED燈源、一個電位器、一個開關共同組裝完成。該暗盒由USB電源供電，充電方便，便于攜帶；電位器開關可以控制LED光源的強弱，利于拍照成像。該套暗盒使用簡單易上手，同時成本低廉，制作簡便。

圖1 暗盒裝置示意圖

2 試驗方法

2.1 人工抗原的制備

喹諾酮母核人工抗原的制備方法參照文獻[15]。合成的諾氟沙星人工抗原PBS透析后保存備用。

磺胺母核人工抗原的制備參照文獻[16]。首先合成磺胺藥物共有的母核結構苯甲酸對氨基苯磺酰胺（SH），再與BSA偶聯，最后置于PBS溶液中透析后保存備用。

2.2 檢測方法

將透析完成的喹諾酮類人工抗原和磺胺類人工抗原固定于微孔板底部形成微陣列，再在微孔中分別滴加50 μL不同濃度的標準品或待測樣品和抗體，然后將微孔用蓋板膜覆蓋置于37 ℃的微孔板恒溫震蕩儀上反應45 min，轉速900 r/min。將反應后的微孔條用去離子水沖洗，拍干。再分別依次滴加50 μL顯色液A和50 μL顯色液B，將滴加有顯色液的微孔條覆蓋置于微孔板恒溫震蕩儀中按900 r/min反應7 min。反應結束后拿出孔板洗凈拍干，將經過顯色處理的孔條放入自制的暗盒里，用智能手機進行拍攝獲取圖像。將智能手機拍攝獲取的照片通過Photoshop 2020處理后，再通過軟件Genepix提取對應孔點的信號值進行數據處理與分析。

2.3 豬肉樣品的處理方法

豬肉樣品購買于當地市場，經HPLC-MS證實所購買的豬肉樣品中喹諾酮類和磺胺類抗生素未檢測。

將購買來的豬肉絞碎，分別取1.00 g的肉樣于5 mL離心管中，向各個離心管中分別加入2 mL乙腈，在旋渦混合器混合5 min后，放入離心機離心；最后，每份取1 mL上清液于離心管中，在65 ℃氮吹儀中進行氮吹后再加入500 μL PBST復溶，供分析檢測使用。

3 結果分析

3.1 條件優化

在免疫反應中，方法的靈敏度和抗體的濃度、抗體體積、溫度、時間、轉速等均有很大關系，需要進行相應的條件優化。將納米材料標記后的抗體稀釋為1∶50，1∶100，1∶200和1∶400四個倍數，計算QNs 1 μg/kg和QNs 0 μg/kg的信號值比值以及SAs 10 μg/kg和SAs 0 μg/kg的信號值比值，信號值比值越小，說明靈敏度越高，依此選擇最佳抗體稀釋倍數。同理，將加入的抗體體積設置為25，50，75和100 μL四個體積，將反應溫度設置為27，32，37和42 ℃四個溫度，將反應時間設置為15，30，45和60 min四個時間，將反應轉速設置為300，600，900和1 200 r/min四個轉速。

根據試驗結果得出，喹諾酮類和磺胺類抗體濃度稀釋倍數均為1∶100，反應體積50 μL、反應溫度37 ℃、反應時間45 min、轉速900 r/min時為最佳反應條件。后續檢測在此條件下進行。

3.2 喹諾酮類和磺胺類特異性實驗

用間接競爭法分別測定抗喹諾酮類抗體與喹諾酮類藥物、抗磺胺類抗體與磺胺類藥物的交叉反應性，計算交叉反應率。計算結果如表1所示。

表1 喹諾酮類和磺胺類抗體的交叉反應率

3.3 標準曲線的建立

在固定有合成的喹諾酮和磺胺類人工抗原的微孔內依次加入50 μL的0，0.2，0.4，0.8，1.6和3.2 μg/kg諾氟沙星和0，2.5，5，10，20和40 μg/kg磺胺甲基異噁唑標準品混合物，再在每孔加入50 μL納米材料標記的喹諾酮和磺胺抗體。在37 ℃、搖床轉速為900 r/min的條件下反應45 min。待反應完全后再顯色，提取一系列的信號值。智能手機拍攝的顯色后芯片如圖2所示。以濃度對數為橫坐標，抑制率為縱坐標，得到喹諾酮和磺胺的標準曲線，如圖3所示。抑制率為喹諾酮和磺胺不同濃度時與濃度為0時的信號值百分比。

圖2 手機拍攝顯色后孔板圖

圖3 蛋白芯片法檢測喹諾酮和磺胺的標準曲線

用諾氟沙星、磺胺甲基異噁唑的標準溶液進行競爭抑制試驗，諾氟沙星、磺胺甲基異噁唑的標準曲線線性回歸方程、相關系數、線性范圍如表2所示。方法線性關系良好。

表2 蛋白芯片法檢測喹諾酮、磺胺的回歸方程、相關系數、線性范圍

3.4 豬肉樣品的測定

3.4.1 豬肉中喹諾酮、磺胺的檢測限

檢測20個陰性豬肉樣品中喹諾酮和磺胺的含量，檢測限的計算方法為20個陰性豬肉樣本中喹諾酮和磺胺的檢測結果平均值，加上3倍標準偏差。得出喹諾酮的檢測限為0.2 μg/kg，磺胺的檢測限為1.5 μg/kg。

根據GB/T 21312—2007標準[17]動物源性食品中14種喹諾酮藥物殘留檢測方法 液相色譜-質譜/質譜法檢測限在1.0～3.0 μg/kg；GB 29694—2013標準[18]動物性食品中13種磺胺類藥物多殘留的測定 高效液相色譜法檢測限為5.0 μg/kg。說明此方法靈敏度較高，檢測限低于國標方法。

3.4.2 豬肉樣品的加標回收率

在陰性樣本中分別加入0.5，1和2 μg/kg的諾氟沙星和5，10和20 μg/kg的磺胺各50 μL，然后再在每孔加入50 μL的抗體進行反應，根據標準曲線計算測得的喹諾酮和磺胺濃度，最后算出相應的加標回收率。表3試驗結果為測得3次取平均值。回收率的計算公式如式（2）：

表3 豬肉中喹諾酮和磺胺類抗生素加標回收率及相對標準偏差（SRSD）（n=5）

諾氟沙星、磺胺的樣本加標回收率均在80%～120%之間，相對標準偏差均小于15%，符合GB/T 27404—2008標準[19]中加標回收率的要求。說明基于智能手機的可視化蛋白芯片法準確度和精密度高，可以應用于豬肉中喹諾酮類和磺胺類抗生素的檢測。

4 結論

將智能手機成像技術和蛋白芯片技術相結合，建立了一種簡單快捷檢測豬肉中喹諾酮類、磺胺類抗生素殘留的方法。試驗優化了最佳反應條件，抗體濃度稀釋為1∶100，抗體體積為50 μL、反應溫度為37 ℃、時間為45 min、轉速為900 r/min。該法在測定豬肉樣品中喹諾酮類及磺胺類抗生素藥物時，試驗結果表明標準曲線相關系R2＞0.99，加標回收率在80%～ 120%之間，且SRSD均在15%以內。該方法操作簡單、檢測時間短、經濟節能、可同時進行大量樣本檢測，對于食品分析檢測發展具有重要意義。

試驗方法通過可視化蛋白芯片法來檢測喹諾酮類和磺胺類的抗生素，并且利用智能手機的攝像單元將可視結果成像，代替了芯片分析儀，使檢測過程變得快捷高效。若能進一步開發出手機應用程序，集成像、圖像處理、信號值提取于一體，可快速檢測食品抗生素殘留，即提供一種用于檢測喹諾酮類和磺胺類殘留抗生素的高通量分析技術。該方法成熟之時便可用于基層各檢驗部門等需要檢測大量樣品中喹諾酮類和磺胺類抗生素的殘留量，并大大提高檢測效率，成本低，且無需特殊昂貴的儀器，結果可視化。