雙水相萃取在物理化學(xué)實驗教學(xué)中的應(yīng)用*

侯巧芝，王高峰，吳建麗

(黃河科技學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450063)

物理化學(xué)實驗是化學(xué)、化工、藥學(xué)、材料、環(huán)境等專業(yè)的一門必修課程。作為一門承上啟下的實驗課程，教學(xué)不僅僅是鞏固理論知識，訓(xùn)練學(xué)生的實驗操作和實驗技能，還承擔(dān)學(xué)生的綜合應(yīng)用能力和創(chuàng)新能力的培養(yǎng)目標(biāo)。物理化學(xué)實驗課程主要包括熱力學(xué)、電化學(xué)、化學(xué)動力學(xué)、膠體和表面現(xiàn)象等相關(guān)實驗操作和相關(guān)實驗技能。因為理論基礎(chǔ)強(qiáng)，內(nèi)容抽象，是公認(rèn)難教、難學(xué)的一門課程[1]。其中，熱力學(xué)與相平衡相關(guān)實驗內(nèi)容與工業(yè)生產(chǎn)實際聯(lián)系緊密。傳統(tǒng)的驗證性實驗項目主要是利用實驗得到數(shù)據(jù)，然后依據(jù)數(shù)據(jù)處理畫出相圖，沒有和實際應(yīng)用聯(lián)系起來，學(xué)生做了之后依然不熟悉相圖的實際應(yīng)用。

雙水相是兩種或兩種以上具有一定濃度的親水性溶液混合后靜置呈現(xiàn)互不相溶的兩相的系統(tǒng)[2]。依據(jù)物質(zhì)在兩相間分配系數(shù)的不同而進(jìn)行雙水相萃取分離，由于其具有環(huán)境溫和、操作簡便、經(jīng)濟(jì)省時、易于放大等優(yōu)點[3]，廣泛應(yīng)用在生物大分子分離與提純。如蛋白質(zhì)[4-5]、酶[6]、核酸[7]、干擾素[8]、金屬離子的萃取[9]和天然產(chǎn)物中活性成分的萃取[10]等。

在轉(zhuǎn)型背景下，應(yīng)用型、創(chuàng)新型的復(fù)合人才的培養(yǎng)成為地方應(yīng)用型高校的培養(yǎng)目標(biāo)[11]。實驗教學(xué)被認(rèn)為是提高學(xué)生實踐能力和創(chuàng)新精神的重要教學(xué)環(huán)節(jié)[12]。為了教學(xué)目標(biāo)的達(dá)成，將教師的科研成果與學(xué)科教學(xué)相結(jié)合，成為高校人才培養(yǎng)的重要途徑之一。在這樣的背景下，實驗教學(xué)中進(jìn)行了以“PEG/(NH4)2SO4雙水相萃取梔子黃色素”為例的教學(xué)新創(chuàng)實驗，包括相圖繪制、波譜掃描分析、萃取分離、數(shù)據(jù)處理等知識和技能，學(xué)生根據(jù)層次不同自主選擇相應(yīng)實驗難度，滿足其個性化發(fā)展的需要，實現(xiàn)因材施教、分類培養(yǎng)的目標(biāo)。通過引入該實驗，不但可以鞏固相關(guān)的理論知識應(yīng)用，培養(yǎng)學(xué)生實驗技能和數(shù)據(jù)處理分析能力，拓寬學(xué)生的視野，加強(qiáng)思維能力的訓(xùn)練，培養(yǎng)學(xué)生的綜合應(yīng)用能力和創(chuàng)新意識，而且還可以引導(dǎo)學(xué)生了解發(fā)展前言，激發(fā)學(xué)生的科研興趣。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

梔子果實，產(chǎn)于江西撫州；硫酸銨，天津市永大化學(xué)試劑有限公司；聚乙二醇1000(PEG1000)，上海展云化工有限公司；實驗用水，皆為重蒸水。TU-1810紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；YWW遠(yuǎn)紅外鼓風(fēng)干燥箱，天津市華北實驗儀器有限公司；KQ-300超聲波清洗儀器，昆山市超聲儀器有限公司；XFB-200粉碎機(jī)，吉首市中誠制藥機(jī)械廠。

1.2 相圖的繪制

25°C下，根據(jù)Albertsson[13]濁點法，分別測定并繪制PEG與(NH4)2SO4溶液形成的體系相圖。準(zhǔn)確稱取2.0 g 40%的PEG1000溶液置于試管中，邊振搖邊滴加40%的(NH4)2SO4溶液，直到溶液狀態(tài)呈渾濁，記錄滴加(NH4)2SO4的質(zhì)量。接著邊振搖邊向溶液滴加蒸餾水，直到混合溶液再次變清，記錄蒸餾水的質(zhì)量。不斷重復(fù)上述操作，分別記錄滴加(NH4)2SO4和蒸餾水的質(zhì)量。以聚乙二醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為縱坐標(biāo)，硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為橫坐標(biāo)繪制相圖。

1.3 梔子粉末的制備

梔子果實置于干燥箱中恒溫(50 ℃)干燥24 h，以粉碎機(jī)粉碎，過0.178 mm篩，再將梔子粉末于干燥箱中恒溫(50 ℃)干燥3h，冷卻后保存于廣口瓶中備用。

1.4 梔子黃色素的萃取條件

準(zhǔn)確稱取1.0 g梔子粉末加入 30 mL 雙水相溶液(硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%，PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)為24%)中，得到料液比1∶30 g/mL的溶液，然后在40 ℃下超聲50 min，抽濾后靜置；讀取上下相體積；以不加梔子粉末的同條件下的雙水相為空白對照，在最大波長處分別測上下相測吸光度A。

取上相溶液，稀釋至合適濃度，在400～700 nm區(qū)間掃描，梔子黃色素的最大吸收波長為532 nm。

1.5 萃取工藝的優(yōu)化

1)單因素實驗

保持1.4基本條件不變，改變其中的一個條件，考察PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)(20%、22%、24%、26%、28%、30%、32%)、料液比(1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70 g/mL)、(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)(8%、10%、12%、14%、16%、18%、20%)和超聲時間(10、20、30、40、50、60、70 min)對梔子黃色素萃取的影響。

2)正交實驗

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，設(shè)計PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)、料液比、(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)和超聲時間四因素三水平的正交實驗優(yōu)化實驗條件。

1.6 梔子黃色素萃取率計算[14]

萃取率：

Y=(RK/1+RK)×100%，

R=V上/V下，K=ρ上/ρ下=A上/A下

其中，K為分配系數(shù)，ρ上為上相濃度，ρ下為下相濃度，A為吸光度，R為上、下相體積之比，Y為萃取率。

2 結(jié)果與分析

2.1 相圖的繪制

繪制PEG1000-(NH4)2SO4雙水相相圖如圖1。從圖1可知，平滑線以上的區(qū)域為兩相區(qū)，以下區(qū)域為單相區(qū)。雙水相萃取考察聚乙二醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)和硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)對萃取率得影響時，兩者質(zhì)量分?jǐn)?shù)的選擇需在曲線以上的兩相區(qū)。

圖1 PEG-(NH4)2SO4雙水相相圖

2.2 單因素實驗

1) PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)對梔子黃色素萃取率的影響

PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)對梔子黃色素萃取影響如圖2。從圖2可知，隨著PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，梔子黃色素萃取率開始增加很快，在PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)為24%時達(dá)到最大值，隨后又開始緩慢降低。綜合考慮正交實驗PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)的三個因素選擇24%、26%和28%。

圖2 PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)對梔子黃色素萃取率的影響

2)料液比對梔子黃色素萃取率的影響

料液比對梔子黃色素萃取率的影響如圖3。從圖3可知開始隨著料液比的增加，梔子黃色素的萃取率快速增大，在料液比1∶30 g/mL時，萃取率達(dá)最大，之后又降低。降低至一定值時，又變緩。綜合考慮正交實驗選擇料液比的三個因素1∶20、1∶30和1∶40 g/mL。

3) (NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)對梔子黃色素萃取率的影響

(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)對梔子黃色素萃取率的影響如圖4。從圖4可知，隨著(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，梔子黃色素萃取率先緩慢增大，在(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為16%時，萃取率達(dá)最大，之后又快速降低。綜合考慮正交實驗選擇(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)的三個因素為12%、14%和16%。

圖3 料液比對梔子黃色素萃取率的影響

圖4 (NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)對梔子黃色素萃取率的影響

4) 超聲時間對梔子黃色素萃取率的影響

超聲時間對梔子黃色素萃取率的影響如圖5。從圖5可知，隨著超聲時間的增加，梔子黃色素的萃取率先增大，50 min達(dá)最大值之后又減小。綜合考慮正交實驗選擇超聲時間為40、50和60 min。

圖5 超聲時間對梔子黃色素萃取率的影響

2.3 正交實驗

依據(jù)單因素實驗結(jié)果，建立PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)、料液比、(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)和超聲時間四因素三水平L9(34)如表1，結(jié)果分析如表2。

表1 正交實驗因素水平表

由表2可知，正交實驗的最佳工藝條件條件為A2B2C3D2，即PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)26%，料液比 1∶30 g/mL，(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)16%，超聲時間 60 min。四因素中超聲時間對梔子黃色素萃取率的影響最大，其次為PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)，料液比對梔子黃色素萃取率的影響最小。

表2 L9(34)正交實驗結(jié)果分析表

2.4 驗證性實驗

在最佳實驗工藝條件下平行三份實驗，梔子黃色素的平均萃取率為93.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.1%。和正交實驗結(jié)果一致。

3 結(jié)語

該實驗將相平衡理論知識和實際提取應(yīng)用相結(jié)合，開拓實驗的深度和廣度。儀器操作簡便，實驗重復(fù)性好，適用于實驗教學(xué)。學(xué)生利用小組繪制的相圖作為單因素實驗的條件參考。實驗中不但可以鞏固理論所學(xué)知識，學(xué)生在實驗過程遇到問題，通過查閱資料，會產(chǎn)生新的想法，激發(fā)了學(xué)生實驗探究的興趣，培養(yǎng)了學(xué)生的科研思維。在該實驗教學(xué)實施時需注意以下問題：

1)開課前制定并公布詳實的考核評價量表，如考察因素的多少和數(shù)據(jù)處理分析質(zhì)量均應(yīng)有相應(yīng)的權(quán)重，學(xué)生可以結(jié)合自身學(xué)習(xí)情況進(jìn)行個性化的選擇。鼓勵學(xué)有余力的學(xué)生拓展探究的深度和廣度，如增加溶劑的選擇、降解動力學(xué)研究等。增加相應(yīng)的內(nèi)容，成績評定根據(jù)情況加上相應(yīng)的績點成績。這樣可以更好地激發(fā)學(xué)生創(chuàng)新的積極主動性，培養(yǎng)學(xué)生解決復(fù)雜問題的能力。

2)因為該實驗項目涉及知識技能點多，開課前教師需要給學(xué)生提供相關(guān)的雙水相萃取、正交實驗設(shè)計等相關(guān)學(xué)習(xí)資料，供有需要的學(xué)生學(xué)習(xí)。該實驗適宜和分析化學(xué)、天然藥物化學(xué)等多學(xué)科聯(lián)合進(jìn)行綜合設(shè)計性實驗。

3)學(xué)生適宜組成4人左右學(xué)習(xí)小組共同探究，鼓勵學(xué)生不局限實驗內(nèi)容，如可以是花色苷、多糖、黃酮類物質(zhì)等萃取，便于學(xué)生個性化發(fā)展的需要。讓小組合作設(shè)計實驗方案，教師根據(jù)具體情況進(jìn)行相應(yīng)指導(dǎo)，啟發(fā)學(xué)生獨立思考和探索，開放實驗室方便學(xué)生隨時進(jìn)行實驗實施，學(xué)生提供解決問題和自主進(jìn)行實驗探究的機(jī)會。