橡膠樹白粉病PMA-qPCR 檢測體系及應用

官 鑫，涂 敏，蔡海濱，王云月，曾 霞，胡彥師

（1.中國熱帶農業科學院橡膠研究所，海南 海口 571101；2.云南農業大學植物保護學院，云南 昆明 650201）

【研究意義】白粉病是橡膠樹生產上最重要的葉部病害，其病原菌鑒定為Erysiphe quercicola［1-2］，為專性寄生菌。該病自1918 年在印尼瓜哇被發現，目前已遍及亞非各國植膠園，主要為害橡膠樹嫩葉（古銅期及變色期葉片）、嫩芽、嫩梢和花序，條件適合時其分生孢子可全年重復侵染，降低橡膠樹光合作用，導致橡膠樹生長遲緩、膠乳產量降低，最高可造成橡膠樹減產45%［3-4］。因此，通過對橡膠樹葉片上白粉病菌活菌量的快速檢測，能及時開展橡膠樹白粉病預測預報及防控，將其對生產的損失降至最低。【前人研究進展】qPCR 是利用熒光信號積累實時監測PCR 進程中每個反應循環擴增產物量的變化，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法［5］。qPCR 技術能夠定量檢測病菌［6-7］，但不能區分病菌的死活，易出現假陽性結果。研究表明，細胞死亡后DNA 仍然能夠保留數天時間。PMA 是一種光敏感、與DNA 高親和力結合的染料，其光解后能穿過死菌的細胞膜與死菌DNA結合形成穩定的共價鍵，從而抑制死菌DNA 擴增。活菌因其具有完整的細胞膜，可將PMA 排除在細胞膜外［8］。因此，利用PMA 對死活細胞的選擇性，結合qPCR 技術，可以實現準確定量檢測活菌的目的。目前該技術已廣泛應用于食源性致病菌［9-10］、醫學病原微生物［11］、水環境病原微生物［12］等，對植物病原菌檢測也有越來越多的報道，已在玉米細菌性枯萎病菌（Pantoea stewartiisubsp.stewartii）［13］、西瓜細菌性果斑病菌（Acidovorax citruui）［14］、青枯菌（Ralstonia solanacearum）［15-17］、獼猴桃潰瘍病菌（Pseudomonas syringaepv.actinidiae）［18］、黃瓜白粉病菌（Podosphaera xanthii）［19］、梨火疫病菌（Erwinia amylovora）［20］、十字花科黑斑病菌（Pseudomonas syringaepv.maculicola）［21］等建立了活菌PMA-qPCR 定量的檢測方法。【本研究切入點】鑒于目前PMA-qPCR 技術在橡膠樹白粉病活菌檢測方面尚無研究報道，根據橡膠樹白粉菌的ITS 保守區序列設計特異性引物，構建PMA-qPCR 分子檢測體系。【擬解決的關鍵問題】本研究擬建立PMA-qPCR 對橡膠樹白粉病活菌的快速檢測體系，為該病害預測預報及防控提供理論依據和技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

橡膠白粉菌（Erysiphe quercicola）、橡膠靈芝菌（Ganoderma pseudoferreum）和禾谷鐮孢菌（Fusarium graminearum）已純化3 代以上，由中國熱帶農業科學院橡膠研究所種質資源課題組分離保存；大腸桿菌（Escherichia coli）菌株由該所陽江華老師贈予。白粉菌接種材料為橡膠樹無性系熱研73397 古銅期組培苗。試驗于2021 年6 月至2022 年2 月在中國熱帶農業科學院橡膠研究所進行。

1.2 活/死分生孢子懸浮液制備

從接種顯癥的熱研73397 橡膠樹白粉病病葉上刮取約1 g 白色粉狀物，置于裝有30 mL ddH2O的50 mL 離心管中，渦旋振蕩，搖勻，用血球計數板計數，制備濃度為1×105個/mL 的新鮮活孢子懸浮液。取15 mL 孢子懸浮液于新的離心管，100 ℃水浴30 min，獲得滅活孢子懸浮液。

1.3 引物設計及特異性檢測

用Primer Premier 5.0 軟件根據本課題組鑒定的橡膠白粉菌的rDNA-ITS 保守區設計引物，其序列為Eq-F：5’ TGCCTGTTCGAGCGTCAT 3’；Eq-R：5’ GCAAGTGGGTTGTTCTGG 3’，擴增產物片段大小為177 bp。引物由鉑尚生物技術（上海）有限公司合成。以橡膠白粉菌、橡膠靈芝菌和禾谷鐮刀菌及大腸桿菌所提取的總DNA 作為模板，以雙蒸水作為空白對照，驗證引物對Eq-F/Eq-R對橡膠白粉菌qPCR 擴增的特異性。qPCR 反應體系與程序參考謝學文等［22］的方法。

1.4 重組質粒制備

以提取的橡膠白粉病菌DNA 為模板進行PCR 擴增，PCR 反應體系及反應程序參考謝學文等［22］的方法，其中反應程序中退火溫度為60 ℃。對PCR 產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳回收目的條帶，PCR 產物經純化后與pMD19-T 于16 ℃連接，轉至DH5α 感受態細胞中，37 ℃過夜培養，挑取白色單克隆，轉于含有Amp 的LB 液體培養基中，37 ℃下200 r/min 振蕩培養12 h。通過PCR驗證和測序〔鉑尚生物技術（上海）有限公司〕檢測插入目的片段的正確性。將測序正確的菌液提取重組質粒，超微量分光光度計測定質粒DNA濃度和純度，根據摩爾定律，計算單位體積質粒所含的DNA 拷貝數濃度，質粒拷貝數=〔質粒濃度（ng/μL）×6.02×1023］/〔（載體長度bp+片段長度bp）×660 g/mol〕。

1.5 qPCR 標準曲線建立及重復性檢驗

將定量后的高拷貝數重組質粒按10 倍梯度稀釋為3.0×109、3.0×108、3.0×107、3.0×106、3.0×105、3.0×104、3.0×103、3.0×102、3.0×101copies/μL，在實時熒 光定量儀上進行qPCR 擴增，反應體系參照1.3，重復3 次。反應結束后獲得線性和可靠的標準曲線（相關系 數R2＞0.99）。選 擇3.0×102、3.0×104、3.0×106copies/μL 的質粒進行組間和組內重復實驗5 次，以確定qPCR 過程中標準曲線的準確性。

1.6 PMA-qPCR 對活/死分生孢子懸浮液檢測

將1.2 中的活/死分生孢子懸浮液按表1 的成分加入1.5 mL 滅菌的離心管中混合，用鋁箔紙將各樣品離心管管蓋以下部分包起來以避光，分別加入20 μL PMA 工作液，使其終濃度為20 μg/mL，置于避光搖床中振蕩孵育5 min（150 r/min）。之后置于冰上，在距離樣品15 cm 處利用100 W藍光燈照射15 min，期間不斷轉動離心管使其均勻照射。光照結束后于離心機10 000 r/min 離心10 min，棄上清液，采用真菌DNA 提取試劑盒提取DNA。以未加PMA 處理的樣品為對照，參照1.3反應體系對樣品進行檢測 。

表1 活/死分生孢子懸浮液配 比Table 1 Compounding ratio of live and dead conidia suspensions

1.7 PMA-qPCR 靈敏度檢測

將1.2 定量后的活孢子懸浮液按10 倍梯度稀釋為1.0×105、1.0×104、1.0×103、1.0×102、1.0×101、1.0×100個/mL，按1.6 中PMA 處理后，提取DNA。使用特異引物Eq-F/Eq-R 進行qPCR擴增，反應體系參照1.3，獲取檢測樣品Ct值，對PMA-qPCR 靈敏度進行分析。

1.8 PMA-qPCR 檢測丙環唑處理后活菌變化

選取10 株古銅期橡膠樹熱研73397 芽接苗接種白粉病菌，待植株發病后，使用40 mg/L丙環唑噴施病葉，采集噴施后0、15、30、60、90、120 min 6 個時期的葉片，每個時期3 次重復。隨后將樣品用液氮研磨成粉末，分別迅速稱取2 管100 mg 粉末于1.5 mL 滅菌離心管中，一管直接提取基因組DNA，另一管內加入1 mL 滅菌的PBS，振蕩15 s。用鋁箔紙將各樣品離心管管蓋以下部分包裹避光，按1.6 中PMA 處理后提取DNA。以未加PMA 處理的樣品為對照，參照1.3反應體系對樣品進行檢測。

試驗數據使用Excel 2010 記錄，利用IBM SPSS Statistics 進行單因素ANOVA檢驗分析差異顯著性，采用OriginPro 2021 軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 引物特異性驗證

利用設計的引物Eq-F/Eq-R 對橡膠白粉菌、橡膠靈芝菌、禾谷鐮刀菌及大腸桿菌的DNA 進行qPCR擴增，結果表明橡膠白粉菌擴增的循環數（Ct值）為20.57，而其他菌株及空白對照均無擴增曲線（圖1A）；反應產物熔解曲線顯示，當Tm值在87.50 ℃時呈單一熔解峰，無引物二聚體和非特異性擴增（圖1B），表明本試驗設計的引物能區分橡膠白粉菌和其他病原菌，特異性良好，能夠用于后續PMA-qPCR 方法的建立。

圖1 引物Eq-F/Eq-R 對橡膠白粉菌的qPCR 特異性擴增曲線（A）和熔解曲線（B）Fig.1 qPCR specific amplification curve (A) and melting curve (B) of primer Eq-F/Eq-R against powdery mildew of rubber tree

2.2 質粒標準品和標準曲線的制備

從白粉病菌基因組DNA 擴增的PCR 產物片段大小為177 bp（圖2）。測序結果表明重組質粒pMD-19T-Eq 構建成功。提取的重組質粒濃度為94.6 ng/μL，根據1.4 中公式計算的拷貝數約為3.0×1010copies/μL。通過梯度PCR 確定最佳退火溫度為60 ℃。以標準質粒10 倍梯度稀釋拷貝濃度 為3.0×101～3.0×108copies/μL，根 據qPCR 檢測擴增結果繪制標準曲線（圖3），擴增反應循環數Ct值與質粒DNA 拷貝數的對數值之間有良好的線性關系：Y=-3.1415×logX+35.398，相關系數R2=0.9981，擴增效率Eff=107.97%。式中，Y為Ct值，X為基因拷貝濃度。

圖2 橡膠白粉菌ITS 保守區PCR 擴增Fig.2 PCR amplification of ITS conserved region of Erysiphe quercicola

圖3 橡膠白粉菌標準曲線Fig.3 Standard curve of Erysiphe quercicola

2.3 qPCR 重復性檢測

選 擇3×102、3×104、3×106copies/μL 3 個梯度的質粒進行組間和組內的重復試驗，以確定qPCR 過程中標準曲線的準確性。結果（表2）顯示，組內變異系數為0.35%～0.58%，組間變異系數為0.97%～1.45%，表明qPCR 的重復性良好，可用于后續試驗。

表2 標準質粒的組間和組內變異Table 2 Variations between and within groups of standard plasmids

2.4 PMA-qPCR 對活/死分生孢子懸浮液的檢測

以qPCR 為對照，對不同比例的活/死分生孢子懸浮液進行PMA-qPCR 檢測，驗證該體系對混合樣品擴增的準確性。結果（圖4）顯示，當懸浮液全部為死孢子時，qPCR 的Ct值為24.50，而PMA-qPCR 的Ct值為31.91，差異顯著。當懸浮液活孢子比例為25%、50%、75%時，隨著活孢子懸浮液比例的增加，PMA-qPCR 的Ct值逐漸減小，分別為29.00、26.92 和26.00；而qPCR的Ct值無明顯變化，分別為24.65、24.16 和23.36，且qPCR 樣品檢測的Ct值均小于PMAqPCR。當樣品懸浮液中活孢子比例達到100%時，PMA-qPCR 的Ct值與qPCR 的Ct值無顯著差異，說明加入PMA 對活孢子的擴增幾乎無影響。同時，懸浮液中隨著活孢子比例的增大，PMAqPCR 的Ct值相應減少，說明死孢子DNA 被PMA 抑制不能擴增，從而降低了qPCR 檢測中由于懸浮液死孢子擴增造成的假陽性。

圖4 不同比例活/死孢子懸浮液qPCR 與PMA-qPCR 結果F ig.4 PMA-qPCR results of different proportions of live/dead spore suspensions

2.5 PMA-qPCR 靈敏度檢測

將 活孢子懸浮液1×105個/mL 按10 倍濃度梯度進行稀釋，經PMA 處理后提取DNA 進行PMA-qPCR 反應。隨著稀釋倍數增加，反應體系中活孢子數量減少，Ct值上升。根據標準曲線得到定量結果見表3，PMA-qPCR 最低可檢測拷貝數為4.77×102copies/μL。

表3 不同稀釋梯度活孢子懸浮液的PMA-qPCR 結果T able 3 PMA-qPCR results of live spore suspensions with different dilution gradients

2.6 PMA-qPCR 檢測丙環唑處理后活菌比例

橡膠葉片噴施丙環唑后，白粉菌活菌比例隨著處理時間的延長整體呈減少趨勢（圖5）。其中，處理后15 min，活菌比例從66.13%下降至23.18%（P＜0.05）；處理后90 min，活菌比例下降至17.43%（P＜0.05）；處理后105 min 活菌比例為13.97%（P＜0.05）。表明PMA-qPCR 能準確定量檢測出經丙環唑處理后橡膠樹白粉病病葉中的活菌數。

圖5 丙環唑處理后橡膠樹白粉病病葉活菌比例F ig.5 Proportion of live bacteria in powdery mildew of rubber tree leaves treated with propiconazole

3 討論

自Nogva 等［23］發現疊氮溴化乙錠（Ethidium monoazide，EMA）能與PCR 技術結合區分活細菌與死細菌以來，該方法已在細菌［24］、病毒［25］等病原微生物中得到應用。但EMA 會部分滲透入活細胞中，造成活菌中基因組DNA 的損失［26-27］。研究發現PMA 能彌補EMA 的這一不足，提高檢測的準確性。目前PMA-qPCR 技術在定量檢測植物病原細菌中應用較為廣泛［28-29］，而在植物病原真菌中的應用較少［30］。本研究首次報道了橡膠樹白粉病PMA-qPCR 檢測體系的建立及其應用。

本研究利用PMA-qPCR 方法對不同活/死孢子懸浮液比例的檢測發現，當樣品全部為死孢子懸浮液時，也會有少量擴增，Tian 等［31］、Elizaquível 等［32］在對西瓜細菌性果斑病菌和食源性細菌檢測中也發現了同樣的現象。研究認為，若樣品中活菌和死菌比例過低時，PMA-qPCR 檢測會比實際樣品中的活菌數高。前人研究發現擴增片段長度越大，對死菌DNA 擴增的抑制效果越好［33］，但靶基因片段過長會減弱擴增的熒光信號，通常qPCR 擴增產物的大小在50～200 bp 時有較高的擴增效率［34］。本研究設計的特異性引物擴增長度為177 bp，對目標菌特異性檢測良好，建立的標準曲線具有較好的線性關系，但當樣品均為死孢子懸浮液時仍有一定擴增量，可能與本試驗中死孢子懸浮液是通過加熱致死獲得、導致其細胞膜未能完全損傷有關，造成了PMA 與死孢子懸浮液DNA 沒有充分結合，從而影響最終的擴增效果，該推測還需進一步驗證。

橡 膠樹白粉病分子檢測方法較少，目前主要有環介導等溫擴增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）［35］和巢式PCR 技術［36］兩種。本研究建立的PMA-qPCR 體系對活孢子懸浮液檢測靈敏度為4.77×102copies/μL，對橡膠樹白粉病早期診斷具有重要作用。目前研究橡膠樹白粉病的生物和化學防治效果主要采用孢子萌發試驗和盆栽試驗。如黃有航等［37］采用上述兩種方法得出枯草芽胞桿菌S43 對橡膠樹白粉病的防效為86.12%；羅嬋娟等［38］利用盆栽實驗測定苯并噻二唑（BTH）對橡膠樹白粉病的防效為57.8%。但上述兩種方法均無法檢測處理后橡膠樹白粉病活菌數。而本研究建立的PMA-qPCR 體系能快速定量檢測出橡膠樹白粉病活菌數。在丙環唑處理15 min 后活菌比例由66.13%下降至23.18%，較處理前有顯著下降，表明本體系可以應用到橡膠樹白粉病防治效果檢測中。

4 結論

本研究建立的橡膠樹白粉病PMA-qPCR 體系，具有重復性好和靈敏度高的特點，能快速、準確地檢測樣品中分生孢子懸浮液活菌量，彌補了常規分子檢測方法不能區分病原菌死活狀態的不足。該體系還能在丙環唑處理橡膠樹白粉病病葉15 min 后，快速定量檢測到橡膠樹白粉病病葉中的活菌比例較未處理前顯著下降，可及時有效地檢測藥劑對橡膠樹白粉病的防效。該PMAqPCR 體系的建立為橡膠樹白粉病的早期預測預報和防效檢測提供了精確的技術手段。