華重樓組培快繁技術研究

吳巧芬，夏 科，趙志國，馬曉雅，仇 碩,

（1.廣西植物功能物質研究與利用重點實驗室/廣西壯族自治區中國科學院廣西植物研究所，廣西 桂林 541006；2.桂林理工大學旅游與風景園林學院，廣西 桂林 541006）

【研究意義】華重樓（Paris polyphyllavar.chinensis）為百合科重樓屬(Paris)植物七葉一枝花的變種之一，也常叫作七葉一枝花，是著名的傳統中藥材，其干燥塊莖是《中國藥典》規定的兩個正品之一［1-2］，也被劃為國家Ⅱ級珍稀瀕危保護植物［3］。華重樓有清熱解毒、消腫止痛、涼肝定驚等傳統功效［2］，現代醫學藥理研究表明華重樓還具有抗腫瘤、抑菌、止血、調節機體免疫力和抗氧化等作用［4-8］，以華重樓為原料的中成藥已有多種被中國食品藥品監督管理局（CFDA）批準用作化妝品原料藥［3］。隨著華重樓藥用成分逐步開發與利用，其藥用價值越來越高，市場需求量逐年遞增，過度的采挖和生境的破壞導致野生資源驟減［9］。近年來，華重樓種植規模逐漸擴大，導致優良種苗供不應求，價格居高不下，因而，華重樓種苗的組培快繁亟待突破，以滿足市場需求的同時保護野生資源。【前人研究進展】研究表明，華重樓喜歡陰涼及土質疏松肥沃的生境，要求水源充足但不能積水，可于毛竹林或杉樹林等林下套種或仿野生種植，也可以遮陰種植［10-14］。然而，華重樓大規模種植較少見，基本都是零散或小規模種植，除種植周期過長（7～10 年）及種養技術要求高外，種苗稀缺且價格高也是阻礙其規模化發展的重要因素。低溫層積結合一定濃度的赤霉素誘導可以打破種子休眠，縮短發芽時間［15-16］。在組培快繁研究方面，華重樓根莖、種子、子葉、子房、芽等常被用作外植體，然而能否誘導出愈傷組織的報道不統一，而且存在污染率高、誘導率低且不穩定、增殖慢以及難分化等問題［17-20］。王躍華等［21］以華重樓子葉為外植體，愈傷組織誘導率只有22.35%。楊麗云等［22］利用云南重樓的嫩芽進行組織培養與植株再生研究，但存在增殖周期過長（210～240 d）以及增殖系數低（1～2 倍）的問題。劉銀花等［23］以華重樓根莖為外植體，不僅獲得了愈傷組織，還誘導出不定芽及生根。徐梅珍等［24］通過無菌播種獲得幼苗，再直接壯苗和生根培養，可獲得華重樓種苗。國外也有通過非成熟的合子胚建立重樓再生體系的研究報道［25］。【本研究切入點】目前仍未見通過組培規模化繁殖華重樓種苗或推廣生產的報道，說明現階段華重樓組培繁育仍未能滿足生產需求。為此，本研究通過探討華重樓的最佳消毒方式，篩選最適外植體，建立無菌體系，并進一步篩選誘導培養基、增殖培養基以及適宜叢生芽生根和結鱗莖的最優培養基，進而建立華重樓組培快繁技術體系。【擬解決的關鍵問題】通過系統的試驗方案，找到最適合建立華重樓無菌體系的消毒方式和外植體，提高誘導率、叢生芽增殖系數以及生根和結鱗莖率，完善華重樓組培快繁技術體系，為規模化生產優質種苗提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2019 年9—10 月，在湖南省邵陽市新寧縣崀山鎮采集華重樓自然繁育獲得的成熟種子，去掉紅色外種皮，清洗干凈，挑選外形飽滿的種子用50 mg/L GA3溶液浸泡24 h，置于泡沫盒內，細沙層積，沙子深度5 cm 左右，濕度保持30%～40%，表面覆蓋報紙，于5～10 ℃的環境溫度放置3 個月，種子露白后轉入室溫放置1 個月，長出根系2～3 根，根長1～3 cm；再轉入5～10 ℃的環境溫度放置3 個月，然后轉入室溫，待種子萌發新芽，至幼苗展開1 片葉、高5～10 cm、根長1～3 cm，備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體預處理及消毒 以去掉葉片的華重樓幼苗為外植體，用0.5%洗潔精清洗表面泥沙，備用。設置3 種不同預處理和消毒方式：（1）外植體未經預處理，超凈工作臺內用75%無水乙醇浸泡45 s，無菌水沖洗1 次，再分別用0.05%、0.1%、0.2% 的HgCl2或2%、4%、8% 的NaClO進行表面消毒10 min，無菌水沖洗5 次；（2）外植體分別經預處理A（流水沖洗2 h）、預處理B（0.05%多菌靈浸泡2 h）或預處理C（0.5%多菌靈浸泡2 h），轉入超凈工作臺，75%無水乙醇浸泡45 s，無菌水沖洗1 次，再用0.1%HgCl2浸泡10 min；（3）外植體經預處理C（0.5%多菌靈浸泡2 h），轉入超凈工作臺，75%無水乙醇浸泡45 s，無菌水沖洗1 次，再用0.1%HgCl2分別消毒6、8、12 min。每個處理3 次重復，每個重復40～50個外植體，接種至培養基MS+1.5mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+30 g/L 蔗糖進行培養，pH=5.8。培養條件：溫度25(±2) ℃，光照強度300～500 lx，光照時間12 h/d。30 d 后統計外植體污染情況，定期觀察并記錄外植體生長情況。

1.2.2 外植體的篩選 按照1.2.1 的方法，將完整的華重樓幼苗用0.5%多菌靈預處理2 h，0.1%HgCl2消毒10min，分別取葉片、葉柄、根、莖段（葉片和幼嫩塊莖之間的部位）、幼嫩塊莖、去掉莖葉的幼苗（含根和幼嫩塊莖）以及幼苗（帶根的完整植株）為外植體，接種到誘導培養基MS+0.1 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L GA3+30 g/L 蔗糖中培養，pH=5.8。每個處理3 次重復，每個重復20個外植體，培養溫度25（±2）℃，光照強度300～500 lx，光照時間12 h/d。定期觀察并記錄外植體誘導出愈傷或不定芽的情況。

1.2.3 不定芽誘導培養 按照1.2.1 的方法，將完整的華重樓幼苗用0.5%多菌靈預處理2 h，0.1%HgCl2消毒10 min，以去掉莖葉或完整幼苗（含根系）為外植體，接種到不同誘導培養基中：（1）以MS 為基本培養基，6-BA 濃度分別為0.1、1.0、1.5、2.0 mg/L，NAA 濃度為0.25、0.5 mg/L，GA3濃度為0、0.5 mg/L；（2）以WPM為基本培養基，ZT 濃度分別為1.0、1.5、2.0、2.5 mg/L，NAA 濃度為0.1 mg/L。上述培養基均添加蔗糖30 g/L，pH=5.8；每個處理3 次重復，每個重復20 個外植體，培養溫度25(±2) ℃，光照強度300～500 lx，光照時間12 h/d。定期觀察并記錄外植體變化情況，30 d 后統計不定芽的誘導率。

1.2.4 不定芽增殖培養 將1.2.3 中誘導出的不定芽繼續培養90～120 d，得到分蘗的不定芽或增大的鱗莖，用解剖刀沿分蘗點切割，或將增大的鱗莖平均切割為2～4 份，轉到不同的增殖培養基：（1）以MS 為基本培養基，6-BA 濃度分別為0.1、1.0、1.5、2.0 mg/L，NAA濃度為0、0.5 mg/L，GA3濃度分別為0、0.5mg/L，IAA濃度為0、1.0 mg/L；（2）以WPM 為基本培養基，ZT 濃度分別為1.0、1.5、2.0 mg/L，NAA 濃度為0.1 mg/L。上述培養基均添加蔗糖30 g/L，pH=5.8；每個處理3 次重復，每個重復20 個不定芽或鱗莖；增殖培養溫度25(±2) ℃，光照強度300～500 lx，光照時間12 h/d。定期觀察并記錄外植體生長情況，90 d 后統計增殖系數。

1.2.5 不定芽生根和結鱗莖培養 將增殖培養獲得的不定芽增殖培養2～4 代后，轉接到生根和結鱗莖培養基，以WPM 為基本培養基，ZT 濃度分別為1.0、1.5、2.0 mg/L，NAA 濃度為0.1、0.2 mg/L，蔗糖30 g/L，pH=5.8。每個處理3 次重復，每個重復20 個不定芽，培養溫度25(±2) ℃，光照強度300～500 lx，光照時間12 h/d。定期觀察并記錄植株生長情況，90 d 后統計生根數量及生根和結鱗莖率，用直尺測定根長和鱗莖直徑。

1.2.6 生根苗移栽馴化 于2021 年3—5 月和6—8 月，把1.2.5 獲得的生根和結鱗莖的生根苗，移出室外煉苗15 d，洗凈根部，晾干水分，移栽到不同基質中，分別為基質Ⅰ（泥炭土∶珍珠巖∶河沙=2 ∶1 ∶1）、基質Ⅱ（泥炭土∶黃壤土∶珍珠巖=2 ∶1 ∶1）、基質Ⅲ（泥炭土）及基質Ⅳ（河沙），以上基質配比均為體積比，每個處理20 株，3 次重復。置于塑料大棚內，夏季采用90%遮陽網遮陰。移栽馴化30 d 后，統計移栽成活率。

試驗數據采用Excel 2007 進行處理，用SPSS 22 進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 不同預處理和消毒方法對華重樓外植體消毒效果的影響

從表1 可以看出，未經預處理的華重樓外植體經過0.05%～0.2%HgCl2消毒后，污染率均高于經2%～8% NaClO 消毒的外植體。隨著HgCl2或NaClO 的濃度升高，污染率明顯降低，其中8%NaClO 消毒10 min 后，外植體污染率為0，但外植體經2%～8%NaClO 消毒后均呈不同程度的乳白色，甚至半透明，不能誘導出叢生芽或愈傷組織，說明受到了嚴重傷害（圖1A）。而經HgCl2消毒處理的外植體能誘導出新芽或愈傷組織，其中0.1%HgCl2消毒處理的污染率為58.17%，萌芽后發育狀態較好（圖1B）；0.2%HgCl2消毒處理后外植體污染率下降到41.83%，但受傷害較嚴重，萌芽慢且發育遲緩（圖1C）。

圖1 不同預處理和消毒方法對外植體消毒效果的影響Fig.1 Effects of different pretreatment and sterilization methods on explants

當外植體先經過流水沖洗2 h 或多菌靈浸泡2 h 的預處理后，再依次用75%乙醇和0.1%HgCl2消毒處理，污染率均下降到20%以下，其中0.5%多菌靈浸泡2 h 的預處理方式效果最好，污染率僅1.67%（表1）。而在外植體先經過0.5%多菌靈浸泡2 h 和75%乙醇浸泡45 s，發現0.1%HgCl2消毒6～8 min，污染率稍有升高，而消毒12 min的污染率也很低，但外植體變化緩慢。綜合污染率及誘導后的新芽發育情況，最好的消毒措施為：0.5%多菌靈浸泡2 h，75%乙醇浸泡45 s，0.1%HgCl2消毒10 min，污染率控制在1.67%，誘導的新芽長勢最好。

表1 不同預處理和消毒方法下外植體的污染率Table 1 Contamination rate of explants with different pretreatment and sterilization methods

2.2 不同外植體對華重樓誘導效果的影響

以華重樓幼苗葉片、葉柄和莖段為外植體，能夠誘導出愈傷（圖2A、B），但誘導率普遍較低，僅10%左右，而且容易出現褐化現象；根系不能誘導出愈傷或不定芽；幼嫩塊莖能夠誘導出不定芽，但誘導率只有25%左右，而以去掉莖葉的幼苗（僅含根和幼嫩塊莖）或幼苗（完整植株）為外植體，容易誘導出不定芽或愈傷（圖2C～G），誘導率均在80%以上。

圖2 不同外植體對華重樓誘導效果的影響Fig.2 Effects of different explants on the induction of Paris polyphylla var. chinensis

2.3 不同培養基對華重樓不定芽誘導效果的影響

以華重樓幼苗或去掉莖葉的幼苗為外植體，不同培養基對不定芽誘導效果（表2）表明，以MS 為基本培養基，添加6-BA 0.1 mg/L、NAA 0.5 mg/L、GA30.5 mg/L 的激素配比，不定芽誘導率達83.33%；當升高6-BA 濃度，降低NAA 濃度，不添加GA3，誘導率下降為56.67%～70.00%。從表2 還可以看出，以WPM 為基本培養基時，不定芽誘導率均高于90%，其中以添加ZT 2.0 mg/L、NAA 0.1 mg/L 激素配比的不定芽誘導率最高，達98.33%，同時芽的發育狀態也較好。綜上，華重樓不定芽誘導最佳培養基為WPM+2.0 mg/L ZT+0.1 mg/L NAA+30 g/L 蔗糖。

表2 不同培養基下華重樓不定芽的誘導率Table 2 Induction rate of adventitious buds of Paris polyphylla var. chinensis with different media

2.4 不同培養基對華重樓不定芽增殖效果的影響

從表3 可以看出，增殖效果最好的培養基為4 號（MS+2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L IAA+30 g/L蔗糖，圖3D），增殖產生的不定芽較多，增殖系數達3.75，顯著高于其他培養基；其次為2 號（MS+0.1 mg/L6-BA+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L GA3+30 g/L 蔗糖，圖3A），增殖系數達3.25，不定芽生長整齊、健壯；其他培養基增殖系數相對較低（圖3B、C）。

圖3 不同培養基對華重樓不定芽增殖的影響Fig.3 Effects of different media on adventitious buds multiplication of Paris polyphylla var. chinensis

表3 不同培養基下華重樓不定芽的增殖系數Table 3 Propagation coefficient of adventitious buds multiplication of Paris polyphylla var. chinensis with different media

2.5 不同培養基對華重樓不定芽生根和結鱗莖效果的影響

表4 結果顯示，以WPM 為基本培養基，NAA 濃度為0.1 mg/L，隨著ZT 濃度的升高，華重樓不定芽生根及結鱗莖率逐漸增大，生根數逐漸增多，根系更長，鱗莖直徑也變大，當ZT 濃度為2.0 mg/L 時，生根及結鱗莖率96.67%，生根數3.84 條，根長4.15 cm，鱗莖直徑0.86 cm；當ZT 濃度為2.0 mg/L，而NAA 濃度增加為0.2 mg/L時，生根數4.92 條，根長4.75 cm，但生根和結鱗莖率稍有降低（88.33%），鱗莖直徑較小，只有0.53 cm。由圖4 可知，華重樓不定芽生根和結鱗莖最好的培養基為3 號（WPM+2.0 mg/L ZT+0.1 mg/L NAA+30 g/L 蔗糖，圖4D、E）。觀察還發現，叢生芽培養90 d 時葉片不能展開，繼續培養至150 d 左右葉片展開，根系變得粗壯，甚至出現變綠的現象（圖4B、E）。

圖4 不同培養基對華重樓不定芽生根和結鱗莖效果的影響Fig.4 Effects of different media on adventitious buds rooting and bulb setting of Paris polyphylla var. chinensis

表4 不同培養基下華重樓不定芽的生根和結鱗莖比較Table 4 Comparison of adventitious buds rooting and bulb setting of Paris polyphylla var. chinensis with different media

2.6 移栽基質和移栽時間對華重樓生根苗移栽馴化的影響

從華重樓生根苗移栽到不同基質后30 d 的成活率（表5）可以看出，3—5 月或6—8 月移栽成活率均較低，其中3—5 月生根苗移栽到基質Ⅰ（泥炭土∶珍珠巖∶河沙=2 ∶1 ∶1）的成活率最高，為30%左右；而6—8 月移栽到室外后，華重樓組培苗均難成活。

表5 不同移栽基質和移栽時間對華重樓生根苗移栽馴化的影響Table 5 Effects of different media and time on transplanting and domestication of tissue culture seedlings of Paris polyphylla var. chinensis

3 討論

組織培養是快速、大量獲得藥用植物優質種苗的重要方式。重樓屬植物組培快繁存在外植體污染率高、誘導率低且不穩定、增殖系數低、瓶內生根困難或者生根率較低等問題。本研究發現，華重樓幼苗或去掉莖葉的幼苗先經過0.5%多菌靈浸泡2 h 的預處理，再用75%乙醇浸泡45 s、0.1% HgCl2消毒8～10 min，外植體污染率控制在5.0%左右，篩選出誘導不定芽的最佳培養基為WPM+2.0 mg/L ZT+0.1 mg/L NAA+30 g/L 蔗糖，誘導率95%以上，且誘導出的新芽生長快（15～30 d）、長勢較好。熊海浪等［26］發現，滇重樓只有種胚能誘導出愈傷組織，而李群等［27］發現重樓屬植物的根和葉片不能誘導出愈傷。羅曉鋒等［28］報道，福建七葉一枝花不同外植體的誘導率差異較大，利用幼苗做外植體，既能誘導出愈傷組織也能分化出幼苗，誘導率達到58.33%；徐梅珍等［24］也利用重樓幼苗成功誘導出組培苗。這些研究結果說明，以幼苗為外植體可能是研究華重樓組培快繁的最適外植體，其原因可能是保留的根系有利于吸收營養成分，而保留的鱗莖（塊莖）部位保留了生長點，有利于萌發新芽。本研究還發現，誘導的華重樓不定芽基部形成明顯膨大的鱗莖，把該鱗莖切割增殖，能增殖出不定芽，增殖系數可達3.75；或直接轉接到生根培養基，能長出根系，鱗莖發育迅速，遠大于同時期移栽室外的幼苗，但葉片展開則需要120～150 d，這可能與其先生根后長葉片的發育習性有關。但這一增殖系數相對大多數植物的增殖系數仍較低［29-31］，仍需要開展提高增殖系數的研究。

組培瓶苗的移栽馴化也是組培快繁技術的關鍵步驟，對大部分植物而言，春季移栽比較適宜萌發新芽，有利于提高移栽成活率。楊麗云等［19］把云南重樓組培苗移栽到腐殖質土，成活率為65%。本研究于3—5 月多次移栽馴化結果表明，華重樓的生根苗移栽成活率均較低，極易引起莖腐病或根腐病，成活率不足30%；而6—8 月移栽均難成活，這可能與桂林地區該季節多雨潮濕有關。據報道，重樓屬植物即使成苗也很容易于多雨潮濕的春季發生病害［27-28］。此外，由于華重樓屬于帶芽越冬休眠，第二年春季再發芽，秋季9—10 月可能更適宜其組培苗的移栽馴化。

4 結論

本研究建立了適合華重樓外植體預處理及消毒的方法以及適宜不定芽誘導、增殖及生根和結鱗莖的組培快繁體系：首先將華重樓幼苗材料經過0.5%多菌靈浸泡2 h，75%乙醇浸泡45 s，0.1%HgCl2消毒10 min，晾干水分后接種至最佳誘導培養基WPM+2.0 mg/L ZT+0.1 mg/L NAA+30 g/L蔗糖中，培養至鱗莖增大或不定芽增多；其次，將鱗莖或不定芽切割成2～4 份，移植到增殖培養 基MS+2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L IAA+30 g/L 蔗糖培養90 d；然后用WPM+2.0 mg/L ZT+0.1 mg/L NAA+30 g/L 蔗糖培養90 d 后生根及結鱗莖；最后可移至室外馴化。整個組培快繁體系可使外植體污染率降至1.67%，誘導率達98.33%，叢生芽增殖系數3.75，生根及結鱗莖率96.67%，根系數3.84 條，根長4.15 cm，鱗莖直徑0.86 cm，3—5 月移栽成活率達到30%。