玉米細胞質雄性不育與恢復基因研究進展

張懷勝，張曉祥，王平喜，進茜寧，吳向遠

（河南科技學院生命科技學院，河南 新鄉 453003）

玉米（Zea maysL.）為禾本科（Gramineae）玉蜀黍屬1 年生草本植物，有玉蜀黍、苞谷、棒子等俗名。玉米起源于南美洲墨西哥地區，從北緯58°的加拿大到南緯40°的阿根廷都有種植，相比水稻和小麥而言，玉米已成為全世界范圍種植最廣的農作物，為全球糧食安全提供了重要保障［1-3］。

雄性不育是高等植物中普遍的生物學現象，指植物在生長發育過程中由于受到環境條件和自身遺傳基因的影響所導致的雄花不能產生裂開的花藥、有功能的花粉但植株的雌性生殖系統發育正常，可以接受外來的花粉而受精的一種生物學現象［4-6］。雄性不育普遍存在于開花植物中，1763 年德國植物學家Joseph Gottlieb K?lreuter 首先發現雄性不育現象以來，已經在主要農作物如玉米、水稻、小麥、棉花、高梁、油菜及其他作物如甜菜、向日葵、洋蔥、辣椒、菜豆、蘿卜等在內的43 科162 屬617 個種或種間雜種中發現了雄性不育現象［7-8］。植物雄性不育根據其表型主要有5 種類型：（1）雄花退化或畸形導致產生花粉的功能喪失；（2）花藥里的孢子囊退化導致敗育的花藥雖然與正常花藥外形相似但不能產生有功能的花粉；（3）花藥內部小孢子退化，引起產生畸形花粉與敗育花粉；（4）花藥中的花粉存在功能缺陷，授粉后不能正常萌發；（5）花藥中的花粉雖然有活力但花藥不開裂［9-10］。

玉米為異花授粉作物，雌花和雄花分開的特征使其成為最早利用雜種優勢的作物并取得了巨大成功，雜種優勢的利用使雜交種的產量比自交系提高15%～50%［11］。在玉米雜交種子生產過程中，利用雄性不育制種不但可以省去大量勞動力，節約制種成本，而且可以避免母本去雄不徹底帶來種子純度下降而導致的產量降低［12］。此外，質-核互作雄性不育的不育機理與恢復機理涉及到線粒體基因和細胞核基因，使其成為研究核-質互作的理想模型［13-14］。因此，對玉米細胞質雄性不育進行研究，不但在生產上可以促進雜種優勢利用，而且對解析質-核互作分子機制具有重要參考價值［15-17］。本文闡述了玉米細胞質雄性不育的特征、分類和恢復基因與不育基因的研究進展，以及玉米細胞質雄性不育利用過程中的問題與展望，以期為玉米細胞質雄性不育在生產上應用提供理論參考。

1 雄性不育的分類

雄性不育現象的發生是內部基因與外部環境條件綜合影響的結果。早在1947 年Sears 把自然界中發現的雄性不育現象劃分為3 種類型：一是細胞核雄性不育（genic male sterility，GMS），其不育性狀受植株的細胞核基因控制且表現出典型的孟德爾遺傳；二是細胞質雄性不育（cytoplasmic male sterility，CMS），其不育性狀受細胞質（線粒體）基因控制遺傳方式為非孟德爾遺傳，屬母系遺傳；三是細胞核-細胞質互作不育（geniccytoplasmic male sterility），其不育性狀由細胞核基因和細胞質基因兩者共同來決定［18］。后來對植物雄性不育的深入研究，發現單一的細胞質雄性不育是不存在的，1956 年Edwardson 將雄性不育重新劃分為兩種類型：細胞核不育類型和細胞質-核互作不育類型即現在所講的細胞質雄性不育（CMS）［19］。

玉米是利用其進行雜交制種最早的作物之一。1933 年首次在秘魯玉米群體中發現了細胞質雄性不育材料，1950 年細胞質雄性不育開始應用于玉米雜交種生產［20］。Beckett 依據育性恢復專效性原理，首次把28 個不同來源的玉米細胞質雄性不育材料劃分為S 型、C 型和T 型3 種細胞質類型［21］。1982 年鄭用璉通過不育系與恢復系測交篩選出一套測驗方法進行玉米細胞質雄性不育材料的胞質分類：用待測不育材料作母本與恢313 進行雜交觀察后代的育性表現，育性恢復的材料劃分為S 型；被保持的材料做母本再與自鳳1 雜交，被恢復的材料劃分為C 型；被保持的劃分為T 型［22］。T 型和C 型均屬于孢子體不育類型，育性受孢子體（植株）基因型決定，與花粉自身基因型無關，敗育發生在減數分裂期，敗育徹底且育性較為穩定。S 型屬于配子體不育類型，育性受花粉自身基因決定；敗育發生在減數分裂后的單核期與二核期，多數不育材料出現育性不穩定現象。

2 玉米細胞質雄性不育與雜種優勢的利用

雜種優勢（Hybrid vigor/Heterosis）指兩個遺傳組成存在差異的親本雜交后代，在營養生長（生活力、生長勢等）、生殖生長（產量、品質、營養等）、抗脅迫（生物脅迫、非生物脅迫）能力方面，均明顯高于親本的生物學現象。雜種優勢的利用是人類利用遺傳規律提高產量最成功的技術手段，早在19 世紀 60 年代，查爾斯達爾文就描述了玉米中的雜種優勢，但直到20 世紀20 年代，玉米的雜種優勢才開始被利用，并成為了第一個商業化應用的雜交作物［23］。近年來隨著科研工作者的不斷探索與努力，目前已經在除了玉米以外的水稻、小麥、油菜等作物上實現了雜種優勢利用［9,24-25］。在玉米、水稻、小麥等農作物的雜交制種過程中，需要進行人工去雄阻止自身花粉的自交結實導致制種的純度下降。去雄過程中消耗大量的人力、物力與財力，而利用“三系”配套制種技術可以很好解決上述問題。

在農業生產中雄性不育材料的發掘與利用是作物利用雜種優勢的基礎，生產上雄性不育材料只有在細胞核基因組攜帶的恢復基因為隱性時才表現出雄性不育現象，如果細胞核所包含的恢復基因為顯性時，細胞質雖然含有不育基因但仍然表現可育［26-27］。玉米細胞質雄性不育系在“三系”雜交制種中的應用如圖1 所示，包括1 個細胞質雄性不育系（細胞核基因為隱性不含恢復基因與胞質基因為不育），1 個保持系（細胞核基因不育而細胞質基因正常）用來保持不育系的繁育，1 個恢復系（細胞核基因為顯性含有恢復基因）。由于不育系不能產生正常的花粉，在制種過程中用來做母本通過與保持系雜交繁殖不育系。細胞質雄性不育保持系與恢復系均可以產生有生殖功能的花粉，兩者均通過自交獲得后代。由于恢復系可以恢復不育系的育性，不育系與恢復系雜交產生的F1代種子可育即生產上利用的雜交種。

圖1 玉米細胞質雄性不育在“三系”雜交制種中的應用模式Fig.1 Application model of cytoplasmic male sterility in three-line hybrid seed production of maize

關于玉米細胞質雄性不育的研究，前期的工作主要是對S 型和T 型不育材料開展。20 世紀50 年代，T 型不育材料開始應用于玉米雜交種的生產，種植面積曾經達到美國玉米種植面積的80%，由于T 型材料高感玉米小斑病，這也引發了玉米小斑病在美國的暴發，導致農業生產遭受巨大經濟損失［28］。S 型不育性不穩定，容易受到環境因素影響導致敗育不徹底，生產應用過程中存在較大風險。C 型不育系來源于巴西玉米品種Churny，不育性穩定，敗育徹底，生產上有較大的應用價值。然而魏建昆研究發現存在對C 型不育材料專化侵染的小斑病生理小種，使C 型不育系在生產上得利用蒙上了陰影；進一步研究發現小斑病C 小種只對C Ⅰ亞組不育胞質專化侵染，不侵染C Ⅱ和C Ⅲ亞組的不育胞質，這就為利用C Ⅱ與C Ⅲ亞組不育材料提供了依據［29］。然而在C 型不育化制種利用過程中最關鍵的問題是缺少強有力的恢復系材料，這一問題一直是限制C型材料應用的關鍵問題。因此發現或創造新的細胞質不育類型與具有強恢復能力的恢復系材料，并對其進行詳盡的分類是解決玉米細胞質雄性不育應用問題的有效途徑［29-31］。

3 玉米細胞質雄性不育基因及其不育機理研究

3.1 玉米細胞質雄性不育基因的發現

1986 年Dewey 利用不育系和可育系的線粒體RNA，分別同不育系線粒體DNA 文庫進行差減雜交，鑒定到1 個T 型不育系特有的基因片段，該片段包含2 個開放閱讀框（ORF）T-urf13和orf25。進一步發現orf25為普通的線粒體基因，而T-urf13編碼一個大小為13 ku 多肽為T 型不育系特有。該基因是玉米中最先發現的不育基因，進一步證明URF13 是一個線粒體內膜蛋白，URF13 通過影響線粒體內層膜通透性造成電子傳遞過程受損能量代謝異常，最終引起花粉敗育［32-33］。Yang等報道了CMS-C 的不育基因是線粒體基因atp6c（表1）［34］。ATP 合成酶又稱F1F0-ATP 合成酶，在線粒體內催化能量物質ATP 的合成，由催化親水性的F1組分和質子轉運的F0組分組成。在呼吸作用過程中，電子傳遞鏈釋放的能量首先轉變為跨膜質子(H+)梯差，最后質子流順質子梯差利用ATP 合酶使ADP+Pi 合成ATP，滿足植物體生長發育對能量的需求。線粒體基因atp6和atpβ分別編碼F0和F1組分的亞基，在87-1 不育系中F1F0-ATP 合成酶復合物積累減少，但F1′組件數量和活性均有增加，造成此現象的原因是不育系線粒體中ATP6C 蛋白與ATP8 蛋白和ATP9 蛋白的相互作用能力強于ATP6 與ATP8 蛋白和ATP9蛋白的相互作用，ATP6C 與ATP6 的競爭使得具有功能活性F1F0-ATP 合成酶的組裝數量的大量減少［34］。同時由于ATP 合成酶為線粒體電子傳遞鏈得最后一個復合物，F1F0-ATP 合成酶組裝減少時，將會引起線粒體內膜空間中超氧陰離子和過氧化氫大量得積累，從而引發細胞內活性氧（ROS）暴發，造成了玉米花藥絨氈層細胞程序性死亡（PCD）的發生時間改變，PCD 的提前發生引起花粉敗育，這一結果與水稻野敗型不育基因WA352類似［34-36］。

表1 已報道玉米CMS 相關不育基因與恢復基因Table 1 CMS related sterility genes and restorer genes in maize reported

在S 型不育系小孢子發育過程中，花粉敗育與嵌合基因orf355-orf77表達密切相關，orf355-orf77為組織特異性表達基因，在花粉表達量高而在其他組織中表達量極低。此外，玉米S 型線粒體基因組以線性形式存在，而orf355恰好位于線性化線粒體基因組的端部，進而轉錄出導致不育的1.6 kb 轉錄本［37］。Xiao 等證明了orf355是S型的不育基因，作者通過酵母篩庫鑒定到了一個基因ZmDREB1.7（為轉錄因子），該基因在花藥中特異表達，基因的亞細胞定位結果顯示其定位于細胞核、細胞質和線粒體，通過EMSA 與酵母單雜交實驗證明ZmDREB1.7能夠結合到orf355基因的啟動子區域并促進orf355的轉錄［38］。

研究發現不育基因Orf355誘導表達后能夠顯著增強線粒體逆向信號，進一步發現其為一個細胞毒性蛋白，ZmDREB1.7能快速響應Orf355表達后的線粒體逆向信號［38］。對ZmDREB1.7進行序列分析結果發現，ZmDREB1.7啟動子區域含有一定數量的未折疊蛋白響應基序，該基序的存在對ZmDREB1.7響應線粒體逆向信號非常重要［38］。在主效恢復基因Rf3不存在的情況下，作者鑒定出一個缺失未折疊蛋白響應基序的單倍型，該單倍型能夠部分恢復S 組玉米的育性，表明其是S 型不育系的弱恢復基因［38］。對于所有細胞質雄性不育而言，一直不清楚的問題是：不育基因為什么僅僅影響花藥或花粉的發育，而對其他組織的生長發育沒有影響？在S 型中推測與花藥特異表達的ZmDREB1.7有關，在花藥中，ZmDREB1.7促進orf355表達，而orf355表達后積累增強線粒體反向信號，反過來促進ZmDREB1.7表達；因此ZmDREB1.7與orf355在S型玉米的小孢子中形成了一個正反饋調控機制，最終導致orf355蛋白的積累和花粉敗育［38］。

3.2 玉米細胞質雄性不育基因來源

細胞質雄性不育在植物界的出現是植物自然選擇增加進化的一種結果，植物之所以選擇殺死雄配子保留雌配子功能的原因是因為植物的雌配子不能隨意移動，促進進化最簡單、最經濟的方法是殺死其雄配子以增加雌花吸收外來花粉的可能性，擴大自身基因的廣泛傳播并產生不同的后代，以利于植物自身的進化與選擇，來適應環境的變化［12］。細胞質雄性不育屬于母體遺傳，線粒體基因重排的形成的新的ORF 是引起花粉敗育的直接原因，也是目前已發現大多不育基因的來源［12］。植物線粒體蛋白是由線粒體以及核基因共同編碼，大約有10%的核基因靶向線粒體，線粒體通過向細胞核發送信號以從核基因組產生各種蛋白，滿足生命活動的需要［39］。在進化過程中，線粒體基因與細胞核基因如果不協調，就會引起線粒體基因發生非同源重組形成許多新的ORF，這些新的ORF 常常參與到RNA 編輯、能量缺失、細胞毒性、活性氧等方面最終會導致雄性不育現象的發生［12］。

4 玉米細胞質雄性恢復基因及其恢復機理研究

4.1 玉米CMS-T 恢復基因的發現

玉米T 型胞質雄性不育屬于孢子體不育，其育性恢復需要2 個互補的顯性核基因Rf1和Rf2［40-41］。Rf1的恢復機制是促進T-urf13轉錄本的加工，產生兩個大小分別為1.6 kb 和0.6 kb 的轉錄本抑制了Turf13表達，使T-urf13編碼的蛋白質URF13 豐度降低80%，Rf1突變為rf1，T-urf13不能產生兩個大小1.6 kb 和0.6 kb 的轉錄本［42］。另外2 個T 型的恢復基因Rf8和Rf*與Rf1的功能相同，但會產生更小的T-urf13轉錄本［42］。恢復基因Rf1并未成功克隆，在所有報道的恢復基因中第1個成功克隆的育性恢復基因是T 型的恢復基因Rf2，其基因序列和哺乳動物乙醛脫氫酶基因同源；Cui 等采用轉座子標簽法克隆了Rf2，它能部分抑制不育基因T-urf3導致的不育表型，但Rf2對不育基因T-urf13轉錄本加工和翻譯后蛋白的豐度不產生影響［40］。推測恢復基因Rf2通過改變線粒體內的代謝水平，來消除毒性蛋白URF13 對線粒體功能產生的損害。進一步研究結果表明：恢復基因Rf2只能部分減輕T 型胞質中URF13 毒蛋白引起的傷害，并未全部使小孢子的育性得到恢復，因此嚴格意義上來講Rf2并非真正的育性恢復基因［31,43］。

4.2 玉米CMS-S 恢復基因的發現

玉米S 型主要恢復基因為Rf3，編碼基因為PPR 蛋白，是一類含有三角狀五肽重復結構的編碼蛋白。研究表明恢復基因Rf3具有靶向線粒體的信號肽能夠進入線粒體。Rf3與線粒體基因orf77結合后抑制orf77基因的功能，通過未知的機制加快不育基因orf355的降解，從而使S 型的不育表型得到恢復［44］。此外，同屬于S 型的恢復基因Rf9，作用是減少線粒體基因orf355-orf77亞基因組的數量來恢復育性，但Rf9由于同時受核背景和環境溫度的影響，與恢復基因Rf3相比，育性恢復效果較差［45］。

4.3 玉米CMS-C 恢復基因的發現

在C 型不育系中目前已發現了兩個恢復基因，分別位于8 號和5 號染色體上的Rf4和Rf5，Rf4為顯性恢復基因可以恢復目前發現的所有的C 型不育材料，而Rf5僅能恢復Rf-I基因缺失的C 型不育材料；且兩個基因存在加性效應，Rf-I基因作為育性抑制基因能抑制Rf5的育性恢復功能［46-48］。Jennifer 等報道了CMS-C 主要恢復基因Rf4是一個bHLH 類型的轉錄因子，通過CRISPR/cas9 編輯后的遺傳轉化證明了Rf4表型，但并未對其功能進行解析［49］。至今關于C 型恢復基因Rf4與不育基因atp6c的作用機理仍不清楚［49-50］。

4.4 玉米細胞質雄性不育恢復基因的來源

自然界進化過程中隨著不育基因的出現，從進化角度來講必然要有恢復基因的存在恢復不育的表型，這樣才能產生有活性的花粉進行后代繁衍。恢復基因的功能解析對于CMS 的分子機制研究至關重要，有關玉米細胞質雄性不育恢復基因除了T 型恢復基因Rf2與S 型恢復基因Rf3被克隆之外，關于恢復基因的報道還很少。關于其它作物研究發現多數恢復基因編碼PPR 蛋白并靶向線粒體發揮而作用，其恢復過程均涉及到了細胞核基因與線粒體基因的互作，而恢復作用則發生在基因水平、轉錄水平、翻譯水平、代謝水平等不同方面［12］。雖然目前對玉米細胞質雄性不育的分子機理的解析還不夠深入，恢復基因與不育基因的互作相對復雜，如C 型不育基因atp6c為線粒體基因，已經克隆并進行了功能研究，C 型恢復基因Rf4是一個轉錄因子是細胞核基因，細胞核基因Rf4是怎樣進入線粒體與atp6c發生作用，目前仍未被解析。

5 玉米細胞質雄性不育利用存在問題與展望

我國科研工作者利用雄性不育這一特性，實現農作物的雜交育種和雜種優勢利用［51-52］。1976 年全國開始在推廣“三系”雜交稻以來，雜交水稻的種植面積快速達到了全國水稻栽培面積的50%，產量增加20%～30%，創造了世界糧食增產的偉大壯舉，使我國的水稻育種一直處在世界領先水平［53］。玉米作為我國重要的糧飼作物，同樣是雜種優勢利用最成功的作物之一，采用細胞質雄性不育進行玉米雜交種生產不僅可以節約制種成本，而且可以提高種子純度與產量。但目前利用玉米細胞質雄性不育與恢復進行制種并沒有得到廣泛的應用，總結起來有以下幾個方面：

（1）玉米品種選育與制種過程中因其異花授粉的屬性，使兩親本之間的雜交相對于小麥、水稻等自花授粉作物而言非常容易。由于這一特征，使得玉米容易利用具有優良性狀的自交系進行雜交育種，獲得的雜交種性狀整齊、抗性更強及穩定性更好。因此基本不采用不育系/恢復系進行制種。

（2）遺傳背景單一的農作物在生產上大面積推廣，使得其對生物或非生物脅迫的抵抗能力下降，存在作物大面積感病、受災減產甚至絕收的風險［8,54］。單一化大面積推廣細胞質雄性不育胞質雜交種，具有潛在的遺傳脆弱性且存在病菌生理小種專化侵染的風險。例如美國在20 世紀50年代玉米生產上開始推廣T型不育胞質雜交種，給玉米生產帶來可觀的經濟效益。但玉米T 型的不育基因T-urf13，同時也是造成玉米對葉斑病原菌敏感的關鍵基因，因此T 型胞質雜交種的大面積推廣利用，直接導致了玉米小斑病T 小種在美國暴發流行，使美國玉米生產遭受巨大的經濟損失，最終T 型不育胞質雜交種退出生產。

（3）玉米細胞質雄性不育與恢復機理尚未得到全面解析且不育胞質的強恢復基因資源缺乏，應用過程中親本導入恢復基因的方法周期長、繁瑣復雜。目前對于玉米細胞質雄性不育系相關分子基礎研究已有很大突破，如CMS-S 的不育與恢復機制已經基本解釋清楚，但是由于S 型不育屬于配子體不育，容易受到環境條件的影響，在利用過程中存在較大風險。CMS-C 的不育機制已經解釋清楚，但恢復基因的研究相對滯后，其內在的分子機理仍不清楚。與此同時，穩定不育材料與含有強恢復基因材料的發現與獲得同樣是限制其利用的重要方面［55］。

2019 年以來，由于受到新冠疫情與國際貿易環境的影響且由于氣候條件的變化，玉米生產環境也在不斷惡化，極端氣候頻繁出現，病蟲害頻發，只有進一步提高玉米單位面積的產量，選育豐產性、抗逆性廣的優良品種，減少玉米生產成本，才能滿足經濟發展與人們對玉米消費持續增長的需求。根據國家“十四五”時期規劃綱要，要深化農業供給結構性改革，優化農業農村生產布局的指導方針。隨著農村勞動力人數減少，而玉米制種屬于勞動密集型產業，不育化制種技術的開發與應用是解決這一問題的一個重要技術手段，不但可以保證玉米雜交種子的純度與質量，進一步提高單位面積的單產，而且可以節約經濟成本，釋放制種過程中消耗的大量勞動力，減少勞動成本的投入。相信隨著科學技術的不斷進步，帶動了分子生物學技術的迅速發展，新技術不斷應用到植物基因工程和分子育種過程種。相信高新育種技術會很好地解決玉米細胞質雄性不育應用中的問題，玉米細胞質雄性不育的應用會有廣闊的發展前景。