高效液相色譜串聯質譜檢測奶粉中喹諾酮類藥物殘留量

王軍鋒*，李安，閆璐璐，張慧君，龐興萍，曹文玉

1. 陜西學前師范學院化學化工學院（西安 710100）；2. 山東省青島市實驗高級中學（青島 266109）

作為嬰幼兒營養獲取的主要來源，奶粉與嬰幼兒的身體健康息息相關。隨著市場的多樣化，奶粉市場魚龍混雜，劣質奶粉可能會對嬰幼兒的成長發育造成不可逆的傷害。近年來，因奶粉質量問題而造成嬰幼兒出現“大頭嬰”、性早熟、腎結石等問題屢見不鮮，因此為保護兒童茁壯成長，奶粉的質量檢測尤為重要。喹諾酮作為一種常見的抗菌藥，針對細菌的DNA，抑制拓撲異構酶，有效阻礙DNA復制和轉錄，從而抑制其繁殖，達到消滅細菌及衣原體等病原體的目的[1-7]。因該藥物具有殺菌強、抗菌廣、作用快、作用廣泛及與其他抗生素無交叉耐藥性等優點[8-10]，對防治細菌性感染等有著極大的效果，被廣泛應用于畜牧業疾病防治。再加上飼養員缺乏生態養殖觀念及相關知識，存在亂用、濫用、超量長期使用獸藥的現象，嚴重影響奶粉的來源——牛肉、羊肉等的質量安全，從而使奶粉受到抗生素的污染。長期服用含有喹諾酮殘留的奶粉會使藥物在嬰幼兒體內堆積，產生細菌的耐藥性，對人體多處產生慢性傷害，產生不良反應[7]。所以多種喹諾酮類藥物被歐美、日本、聯合國糧農組織等列入獸藥殘留檢測名單。2002年原農業部也規定幾種喹諾酮藥物的最高殘留限量[11-13]。基于上述原因，檢測奶粉中喹諾酮類藥物的殘留就變得十分關鍵。喹諾酮藥物殘留檢測手段主要有色譜法、免疫分析法、化學發光法、微生物抑制法等[14-16]。相比之下，色譜法具靈敏度好、分離度高、準確性高、同時高效檢測等特點[17-19]。高效液相色譜與質譜聯用，自動化程度高，更兼具質譜儀良好的化合物識別能力、適用范圍廣、準確性高、重現性好的優點，對于某些檢測樣品不穩定、大分子、極性強的特點也能較好的分離和檢測。

試驗采用先進的HPLC-MS技術，建立一種快速高效精確檢測奶粉中喹諾酮藥物殘留量的方法，并為喹諾酮等抗生素的濫用治理提出建議。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

哇哈哈飲用純凈水（二次去離子水，哇哈哈基團有限公司）；恩諾沙星標準品（1 000 mg/L甲醇溶液，上海安譜實驗有限公司）；環丙沙星標準品（100 mg/L甲醇溶液，上海安譜實驗有限公司）；諾氟沙星標準品（100 mg/L甲醇溶液，上海安譜實驗有限公司）；雀巢怡運全家營養奶粉（雙城雀巢有限公司）。

甲酸（色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司）；冰乙酸（分析純，天津市天力化學試劑有限公司）；乙腈、甲醇（均為色譜純，Honeywell Burdick＆ Jackson公司）。

1.2 儀器與設備

6460 Triple Quad LC-MS（美國安捷倫公司）；Agilent Eclipse Plus C18RRHD 1.8 μm色譜柱（2.1 mm×50 mm，美國安捷倫公司）；離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）；電子分析天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；移液槍及槍頭（大龍興創實驗儀器有限公司）；一次性無菌注射器（上海康德萊企業發展集團股份公司）；0.22 μm有機濾膜（杉羽天津科技發展有限公司）；超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 配制溶液

1.3.1.1 流動相

移取甲酸、乙腈及水，混勻超聲。分別配制0.1%甲酸水溶液，0.1%甲酸乙腈溶液。

1.3.1.2 洗針液

移取乙酸和乙腈溶液，混勻，配制1%乙酸乙腈溶液。

1.3.1.3 定容液

移取乙腈、甲酸和去離子水，混勻，超聲15 min，配制成0.1%甲酸-10%乙腈水溶液。

1.3.1.4 標準儲備溶液

以定容液作為溶劑，分別移取環丙沙星標準品、諾氟沙星標準品、恩諾沙星標準品，各配制質量濃度為500 ng/mL的標準儲備溶液，混勻后低溫避光保存。

1.3.1.5 混合標準溶液

以定容液為溶劑，分別移取適量的3種藥物的標準儲備溶液，混勻，配制一系列濃度為2.5，5.0，10，20和50 ng/mL的混合標準溶液。

1.3.2 色譜條件

柱溫25 ℃；流速0.250 mL/min；最大壓力限400.00 bar；進樣量5.00 μL；進樣模式采用Flush Port洗針2 s；流動相A相為0.1%甲酸水溶液，B相為0.1%甲酸乙腈溶液；流動相梯度洗脫如表1所示。

表1 流動相梯度洗脫

1.3.3 質譜條件

ESI+離子源；離子源氣體溫度350 ℃；氣體流速10 L/min；毛細管電壓4 000 V；霧化器壓力40 psi；質譜多反應監測（MRM）掃描模式。喹諾酮類藥物質譜參數見表2。

表2 喹諾酮類藥物質譜參數

1.3.4 樣品前處理

1.3.4.1 樣品空白

用分析天平稱取2.010 5 g奶粉，用量筒量取20 mL 1%乙酸乙腈溶液，混勻振搖20次，超聲15 min，出現大量白色顆粒沉淀。用移液槍移液于離心管中，并設置離心機參數：4 ℃，5 000 r/min，離心5 min。用移液槍移取少量上清液于旋轉蒸發儀中，在45～55 ℃水浴下，恒定轉速約為90～100 r/min，將乙腈濃縮至干。往旋蒸瓶中加入適量的定容液復溶樣品，采用一次性無菌注射器，吸取溶液過0.22 μm有機濾膜，濾液待測。

1.3.4.2 樣品加標

用移液槍移取500 μL樣品，移取500 μL 10 ng/mL標準混合液，配成1 mL加標絕對量5 ng的樣品加標液。

2 結果與分析

2.1 優化色譜條件

2.1.1 流動相的選取

喹諾酮類藥物具有羧基和叔胺基，呈現酸堿兩性。流動相中加入甲酸：其一，可以減小在氫鍵或離子交換作用下硅羥基對喹諾酮堿性基團產生的強烈吸附而造成譜圖出現保留值不穩定、色譜峰拖尾、分離度下降和峰形異常等現象[20]；其二，甲酸可使3種喹諾酮類化合物及其碎片結合1個質子，呈現正電性，計算質荷比，由此可以用質譜進行化合物的鑒定。乙腈作為有機流動相具有黏度低、使用方便、更高的洗脫能力和與樣品不相互作用等優點。長期使用緩沖鹽易造成結晶析出從而導致色譜柱柱壓升高，化合物保留時間不準等負面影響，故未在流動相中選用緩沖鹽體系。

2.1.2 色譜柱的選取

試驗選用Agilent Eclipse Plus C18RRHD 1.8 μm色譜柱（2.1 mm×50 mm），此柱是十八烷基鍵合硅膠柱，能高效分離且在pH 2～9范圍內對酸性、堿性和中性化合物提供高性能和良好的對稱峰。

2.1.3 運行時間的選取

選取的色譜柱長度是50 mm且3種喹諾酮藥物保留時間大約都在2～3 min內，故運行時間不可設置過長。過長的情況下，3種喹諾酮藥物在3 min以內就流出色譜柱，余下時間體系內只有流動相，浪費時間及溶劑。

2.1.4 流動相梯度洗脫選取

在梯度洗脫開始的時候，設置90%的水相和10%有機相沖洗色譜柱，目的為保證色譜柱中無雜質污染，色譜結果準確。因其藥物流入色譜柱時間與流動相執行洗脫程序的時間相比有延后現象，試驗3種目標化合物均在2.6 min左右開始出峰，所以在1 min左右開始增加有機相的比例，為讓目標化合物的峰形更好，分離好。最后采用與初始梯度洗脫濃度相同的流動相沖洗，防止對后續進樣干擾。

2.1.5 流速參數的選取

流速設置過快會使藥物很快就被流動相沖走，導致保留時間減小且易出現3種藥物分離不明顯的現象，色譜結果不準確。優化后流速設置為0.250 mL/min。

2.1.6 進樣量的選取

溶劑效應是指溶解樣品的溶劑對色譜結果產生影響，使色譜峰出現前伸、拖尾、分裂等現象。為減小溶劑效應，采取2種措施。減小進樣量體積，優化后設置為5.00 μL；配制與初始流動相洗脫強度相近的0.1%甲酸10%乙腈水溶液作為定容液來溶解3種喹諾酮類藥物。

2.2 優化質譜條件

恩諾沙星、環丙沙星、諾氟沙星在ESI+的條件下易于斷裂，產生碎片離子峰。相比于母離子的質荷比，碎片離子峰都丟失18 u，44 u。恩諾沙星的主要碎片離子m/z為316.1和342.1，其分別對應著[M+H-CO2]+和[M+H-F]+。環丙沙星的主要碎片離子為m/z288.1和m/z314.2，其分別對應著[M+H-CO2]+和[M+H-F]+。諾氟沙星的主要碎片離子為m/z275.9和m/z302.1，其分別對應著[M+H-CO2]+和[M+H-F]+。其可能的碎裂機制如圖1～圖3所示。

圖1 恩諾沙星母離子可能的裂解機制

圖2 諾氟沙星母離子可能的裂解機制

圖3 環丙沙星母離子可能的裂解機制

2.3 標準曲線、檢出限、定量限

采用5點校正繪制標準曲線。將配制的一系列質量濃度為2.5，5.0，10.0，20.0和50.0 ng/mL的恩諾沙星、環丙沙星、諾氟沙星的混合標準溶液和樣品加標溶液，經過HPLC-MS檢測，以各自的峰面積對濃度繪制標準曲線，外標法定量，得到線性方程。由圖4～圖6和表3可知，3種喹諾酮藥物在2.50～50.00 ng/mL區間內響應值與對應藥物濃度具有良好的線性關系，其相關系數均大于0.996。

表3 3種喹諾酮藥物的線性方程、LOD、LOQ

圖4 10 ng/mL恩諾沙星的色譜圖、質譜圖

圖6 10 ng/mL諾氟沙星的色譜圖、質譜圖

圖5 10 ng/mL環丙沙星的色譜圖、質譜圖

2.4 回收率

表4 奶粉樣品加標回收率

將奶粉樣品加入3種喹諾酮類藥物標準混合液配成加標量5 ng/mL溶液進行12次平行試驗，測定加標回收率、相對標準偏差。以S/N=3為檢出限，以S/N=10為定量限。如圖7所示，定性離子對設置為最強信號離子對，定量離子對設置為次強信號離子對，以此繪制空白奶粉樣品加標藥物的質譜圖。

圖7 空白奶粉樣品中添加5 ng/mL恩諾沙星、環丙沙星、諾氟沙星標準溶液質譜圖

3 結論與討論

鑒于當今社會抗生素濫用嚴重，病菌易產生耐藥性變成“超級細菌”而危害人類健康，所以檢測抗生素殘留非常關鍵。運用先進的高效液相色譜串聯質譜技術，找到其最優的色譜、質譜條件，建立一種能夠快速、高效、同時檢測奶粉中3種喹諾酮類藥物的分析方法。該方法檢測3種藥物在2.50～50.00 ng/mL范圍內具有線性，且相關系數均大于0.996，其中環丙沙星的相關系數達0.999。將奶粉前處理后，測得的加標回收率分別為83.5%，90.2%和85.9%，SRSD分別為11.4%，14.0%和7.8%，檢出限分別為0.82，0.35和0.68 ng/mL，定量限分別為0.84，0.37和0.92 ng/mL。該方法符合獸藥殘留檢測標準，具有良好的應用前景。