響應面法優化暗褐脈柄牛肝菌粗多糖提取工藝

秦如冰，葉麗，尹嘉梁，張翔，文傳凇，王勇*

熱帶轉化醫學教育部重點實驗室，海南省熱帶藥用植物研究開發重點實驗室，海南醫學院藥學院（?？?571199）

牛肝菌作為肉質大型真菌而被開發廣泛，暗褐脈柄牛肝菌作為其中的成員具有很好的開發潛力。暗褐脈柄牛肝菌（Phlebopus portentosus），又名暗褐網柄牛肝菌、異樣脈柄牛肝菌，隸屬于擔子菌門（Basidionycota），傘菌綱（Aganicomycetes），牛肝菌目（Boletales），小牛肝菌科（Boletinellaceae），脈柄牛肝菌屬（Phlebopus），主要分布在我國云南、廣西和海南。暗褐脈柄牛肝菌個體肥大，味道鮮美，營養豐富，是備受群眾喜愛的名貴食用菌[1]。近年來，圍繞多糖活性的研究，報道了很多多糖的功效[2-3]。Kamchantat等[4]利用水提醇沉法獲得多糖蛋白質復合物，經分離純化后，得到的多糖片段PPC-P11具有很強的抗氧化能力，并且在體外對5種人類細胞株有相對強的抗擴增能力，說明暗褐網柄牛肝菌在抗腫瘤方面有一定的潛力，除此之外還有降低血糖的作用。

為進一步研究暗褐脈柄牛肝菌子實體粗多糖，使其得到更為合理的開發和利用，在單因素試驗考察的基礎上，采用Box-Behnken試驗設計，以子實體多糖提取率為考察指標，進一步優化暗褐脈柄牛肝菌粗多糖的提取工藝，為后續暗褐脈柄牛肝菌子實體粗多糖的藥理活性試驗提供物質基礎。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

1.1.1 材料

暗褐脈柄牛肝菌子實體采自云南西雙版納，經海南醫學院生藥學教研室曾念開教授鑒定為暗褐脈柄牛肝菌（Phlebopus portentosus）的子實體，采集的子實體經切片后烘干，粉碎后過0.425 mm（40目）篩至密封袋內保存備用。

1.1.2 試劑

無水葡萄糖標準品（中國食品藥品檢定研究院）；氯仿、正丁醇、苯酚、濃硫酸（廣州化學試劑廠）。除葡萄糖標準品外其余試劑均為分析純。

1.1.3 儀器和設備

粉碎機（HC-150T2，永康市綠可食品機械有限公司）；新世紀紫外可見分光光度計（T6，北京普析通用儀器有限責任公司）；恒溫水浴箱（HH-6，常州澳華儀器有限公司）；旋轉蒸發儀（RE-52AA，上海亞榮生化儀器有限公司）；電子天平[AL-104，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]。

1.2 方法

1.2.1 暗褐脈柄牛肝菌粗多糖提取率的測定

1.2.1.1 標準曲線的繪制

配制葡萄糖標準溶液：稱取葡萄糖標準品，于105 ℃干燥至恒重，取適量加入少量蒸餾水使其溶解，定容于100 mL容量瓶中，配制成質量濃度10 mg/mL葡萄糖儲備液。精密吸取1 mL儲備液定容至100 mL，配成0.1 mg/mL的葡萄糖標準液。

配制5%苯酚溶液：精確量取0.5 mL苯酚，加入蒸餾水定容至10 mL棕色容量瓶中。

繪制標準曲線：分別吸取0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mL葡萄糖標準溶液置于試管中，分別加水至2.0 mL，各加1 mL苯酚試液搖勻，迅速加入5 mL濃硫酸（與液面垂直加入，勿與管壁接觸，便于反應液充分混合），振蕩混勻后，置于沸水浴中煮沸15 min，取出迅速冷卻至室溫（預先在冰箱制作冰塊，迅速放在冰塊里冷卻）；另以2.0 mL蒸餾水經相同處理為空白對照，在490 nm處測定吸光度，以葡萄糖標準溶液濃度（C）為橫坐標，吸光度（A）為縱坐標，繪制葡萄糖標準曲線，計算回歸方程可得A=0.685 7C-0.001 9，R2=0.999 5。

1.2.1.2 暗褐脈柄牛肝菌粗多糖的提取及提取率測定

稱取2 g暗褐脈柄牛肝菌粉末，精密稱定，置于錐形瓶內，加入超純水進行水浴、過濾和萃取，以超純水定容至100 mL，取適量溶液，加入適量苯酚和濃硫酸[5]，在490 nm下測定溶液吸光度，依據葡萄糖標準曲線，計算暗褐脈柄牛肝菌粗多糖提取率。按式（1）計算。

式中：C為測得的多糖溶液質量濃度，mg/mL；V為多糖溶液測定體積，mL；N為樣品稀釋倍數；m為樣品質量，mg[6-8]。

1.2.2 單因素試驗

1.2.2.1 液料比

取2 g共4份暗褐脈柄牛肝菌粉末，精密稱定質量，置于具塞錐形瓶，分別加入10，20，40和60 mL蒸餾水，置于80 ℃水浴鍋中，水浴提取80 min，提取結束，離心后加等量蒸餾水水浴，冷卻至室溫，合并2次提取液。取10 mL粗多糖溶液，加入10 mL氯仿-正丁醇（預先配制成體積比5∶1混合液）溶液，置于分液漏斗中，充分振搖靜置，去除中間變性蛋白層，將水相與有機相分離。將水相加入10 mL的氯仿-正丁醇溶液，重復上述過程，共計重復4次。取1 mL萃取液定容至100 mL容量瓶，從中取2 mL加入1 mL 5%苯酚溶液，搖勻，迅速加入5 mL濃硫酸，振搖，置沸水浴上加熱15 min，然后置冷水浴中冷卻至室溫，以純凈水經相同處理為空白對照，在490 nm處用分光光度計測定提取液吸光度，計算多糖提取率，比較不同液料比對多糖提取率的影響。

1.2.2.2 浸提溫度

取2 g共4份暗褐脈柄牛肝菌粉末，精密稱定質量，置于具塞錐形瓶中，加入40 mL蒸餾水，分別在70，80，90和100 ℃條件下浸提80 min，按照1.2.2.1小節的方法處理，計算多糖提取率，比較不同浸提溫度對提取率的影響。

1.2.2.3 提取時間

取2 g共4份暗褐脈柄牛肝菌粉末，精密稱定質量，置于具塞錐形瓶中，每份分別加入40 mL蒸溜水，水浴提取溫度80 ℃，提取時間分別為40，60，80和100 min。按照1.2.2.1小節的方法處理，計算多糖提取率，比較不同提取時間對多糖提取率的影響[9-10]。

2 結果與結論

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 液料比對牛肝菌多糖提取率的影響

設定浸提溫度80 ℃、提取時間80 min，對液料比進行優化，結果如圖1所示。

由圖1可知，液料比5∶1～20∶1 mL/g時，隨著液料比逐步增大，多糖提取率逐漸升高，液料比20∶1 mL/g時，提取率最大為15.45%?？赡艿脑蚴牵哼m當的提取溶劑用量可以增加牛肝菌與水的接觸面積，有利于牛肝菌多糖的溶出[11]。液料比超過20∶1 mL/g時，多糖提取率有下降趨勢，可能是由于加入過多的溶劑會增加后續濃縮時間，造成多糖損失[12]。結合響應面的優化特點及實際考慮，液料比選擇20∶1 mL/g。

圖1 液料比對多糖提取率的影響

2.1.2 浸提溫度對牛肝菌多糖提取率的影響

設定液料比20∶1 mL/g、提取時間80 min，對浸提溫度進行優化。由圖2可知，隨著溫度不斷升高，提取率隨之升高，當溫度超過適宜溫度時，提取率隨之下降，可能溫度過高容易造成多糖活性結構等發生改變，多糖提取率大受影響，故溫度升高到80 ℃以后，多糖提取率下降[13-14]。最佳浸提溫度為80 ℃。

圖2 浸提溫度對多糖提取率的影響

2.1.3 提取時間對牛肝菌多糖提取率的影響

設定液料比20∶1 mL/g、浸提溫度80 ℃，對提取時間進行優化。由圖3可知，提取率隨提取時間增加而升高，80 min后提取率開始下降[15-16]，結合響應面的優化特點及實際考慮，提取時間選擇80 min。

圖3 提取時間對多糖提取率的影響

2.2 響應面法優化暗褐脈柄牛肝菌粗多糖提取工藝

2.2.1 提取條件的優化分析

在單因素試驗優化的基礎上，根據Box-Behnken Design（BBD）原理，選擇影響暗褐網柄牛肝菌粗多糖提取率（Y）的液料比（A）、浸提溫度（B）、提取時間（C）3個影響因素作為考察的變量，設計試驗方案，確定暗褐網柄牛肝菌粗多糖最佳的提取工藝。響應面試驗因素及各因素水平見表1，試驗方案及結果見表2。采用Design Expert對試驗結果進行響應面二次回歸擬合分析，得到回歸方程Y=15.85-0.028 7A+0.202 5B-0.038 8C-0.152 5AB+0.520 0AC-0.687 5BC-0.380 5A2-0.253 0B2-0.485 5C2?；貧w方程一次項中各項系數絕對值的大小反映各因素對響應值的影響程度，系數的正負反映影響的方向[17]。

表1 Box-Behnken中心試驗因素水平表

2.2.2 方差分析

由表3可知，該模型p＜0.01，證明此模型差異高度顯著，失擬項p=0.053 5＞0.05，表現為不顯著，說明實測值與預測值之間無失擬存在，說明該數字模型具有較好的預測性[18]?；貧w模型的R2=0.910 3，說明該模型與實際結果擬合良好，試驗方法可靠。對模型各項分析，二次項A2、C2影響顯著或高度顯著，交互項AC、BC差異顯著，表明液料比和提取時間，浸提溫度和提取時間相互作用關系較強。不難看出，一次項中對暗褐網柄牛肝菌多糖提取率的影響依次為浸提溫度＞提取時間＞液料比[19]。

表3 方差分析結果

2.2.3 交互因素分析

響應面圖中越陡峭則顯示該因素對其影響越明顯，反之，越平坦則影響不明顯。等高線圖可以依據其圖形的形狀來判斷其交互影響的程度，若圖形為橢圓則交互現象越明顯，若圖形為圓形則交互現象不明顯[20]。從圖4可以看出，響應曲面圖曲面彎曲程度大小順序是BC＞AC＞AB，浸提溫度與提取時間的響應曲面最陡，其對應的等高線圖的橢圓形扁平程度也最大，說明浸提溫度與提取時間的交互作用最明顯。液料比和提取時間的響應曲面坡度較大，等高線呈橢圓形，說明對多糖的提取率影響較為顯著，液料比和浸提溫度交互作用等高線圖沒有呈現明顯的橢圓形，而是接近于圓形，說明其交互作用不明顯，與回歸方程方差分析結果一致。

圖4 兩兩因素相互作用對多糖提取率影響的響應曲面圖和等高線圖

2.2.4 驗證試驗

應用分析軟件Design-Expert 8.0.6.1，由RSM預測最優值，優化后的暗褐網柄牛肝菌多糖的提取條件為液料比20∶1 mL/g，浸提溫度78.72 ℃，提取時間77.76 min。為驗證響應面法優化預測結果的可靠性，根據試驗可操作性對最佳提取工藝參數稍作調整：浸提溫度79 ℃，提取時間78 min，液料比20∶1 mL/g。在此條件下進行驗證試驗（3個重復），結果顯示暗褐網柄牛肝菌多糖平均提取率為15.95%，與預測值相近。

3 結論

在單因素試驗基礎上，通過Box-Behnken響應面法，對暗褐網柄牛肝菌多糖的提取條件進行優化。結果發現，3個因素對多糖得率的影響大小依次為浸提溫度＞提取時間＞液料比。建立多糖提取率的回歸模型，由該模型優化的多糖提取條件為液料比20∶1 mL/g、浸提溫度78.72 ℃、提取時間77.76 min，多糖提取率為15.99%。在此條件下，對最佳提取工藝參數稍作調整：浸提溫度79 ℃，提取時間78 min，液料比20∶1 mL/g，在此條件下進行驗證試驗，暗褐網柄牛肝菌多糖提取率為15.95%，與模型預測結果相近，說明所建模型與采用的優化方法可靠，適用于暗褐網柄牛肝菌多糖的水提工藝優化和分析[21-22]。