蛋糕中脫氫乙酸提取的正交試驗(yàn)優(yōu)化及其含量的測定

楊旺火，孫麗香，陳月龍，王秋云，劉財(cái)行，陳嘉萍

廈門泓益檢測有限公司，肉食品安全生產(chǎn)技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（廈門 361000）

脫氫乙酸（dehydroacetic acid，DHA），又名脫氫醋酸，是一種新型的人工合成防腐劑，對霉菌和酵母有極強(qiáng)的抑制能力[1-2]。近年來，脫氫乙酸因?yàn)槠涑錾目咕栏芰Χ粡V泛地應(yīng)用在蛋糕等食品中，以延長食品的保質(zhì)期。脫氫乙酸在人體內(nèi)的代謝研究尚不完善，但相關(guān)研究指出，其在人體內(nèi)器官和血液中通過與氨基酸作用，從而抑制多種氧化酶[3]，對人體的腎臟、肝臟及中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生影響，并可能引發(fā)癌癥[4]。為此，美國、日本等國家都制定了嚴(yán)格的限量要求，而在一些歐洲國家甚至明確禁止在食品中使用脫氫乙酸。我國也將其列為SC食品認(rèn)證相關(guān)品類的必檢項(xiàng)目，GB 2760—2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定脫氫乙酸在各類食品中的最大使用量限值，其中蛋糕中脫氫乙酸及其鈉鹽的最大限值為0.5 g/kg[5]。

已報(bào)道的食品中脫氫乙酸主要的檢測方法有氣相色譜法[6-7]、液相色譜法[8-12]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[13]等，而在實(shí)際的檢測和政府監(jiān)管工作中主要的檢測依據(jù)為GB 5009.121—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脫氫乙酸的測定》。大量的日常檢驗(yàn)和企業(yè)產(chǎn)品研發(fā)檢測數(shù)據(jù)表明，采用GB 5009.121—2016中液相法對蛋糕基質(zhì)食品中的脫氫乙酸進(jìn)行測定，其結(jié)果與企業(yè)實(shí)際的添加量存在較大偏差，結(jié)果偏低，說明該標(biāo)準(zhǔn)對蛋糕基質(zhì)的適用性較差。因此，有必要開發(fā)一種能夠準(zhǔn)確測定蛋糕中脫氫乙酸含量的方法，不但能夠幫助企業(yè)客觀地評價(jià)產(chǎn)品的安全性能指標(biāo)，還能夠指導(dǎo)企業(yè)合理使用添加劑，避免造成不必要的經(jīng)濟(jì)損失；另外，一個適用性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高的檢測方法也能為監(jiān)管部門進(jìn)行食品安全監(jiān)管提供有力支持。通過對蛋糕中脫氫乙酸提取條件進(jìn)行單因素試驗(yàn)，利用正交試驗(yàn)法優(yōu)化并確定脫氫乙酸測定的最優(yōu)條件，確立一種能夠準(zhǔn)確測定蛋糕中脫氫乙酸含量的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.9%，墨壇質(zhì)檢）；甲醇（色譜純，德國Meker公司）；乙酸銨（色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；氫氧化鈉、氨水、磷酸、硫酸鋅等（均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；試驗(yàn)用水為GB/T 6682—2008《分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法》規(guī)定的一級水。

1.2 儀器與設(shè)備

Ultimate 3000高效液相色譜儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；LXJ-IIB離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；Unique-R10超純水機(jī)（銳思捷科學(xué)儀器有限公司）；BSA224S-CW分析天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]。

1.3 方法

1.3.1 脫氫乙酸的提取

蛋糕樣品用粉碎機(jī)粉碎或不銹鋼高速均質(zhì)器均質(zhì)后，準(zhǔn)確稱取2 g樣品于50 mL刻度離心管中，加入約10 mL的水，加入不同體積質(zhì)量濃度120 g/L的硫酸鋅沉淀劑，用20 g/L的氫氧化鈉溶液或9 mol/L的磷酸溶液，調(diào)節(jié)至不同的pH后，加水定容至25 mL，充分搖勻，于不同溫度下，超聲提取不同的時間后，以4 000 r/min離心5 min。取上清液過0.45 μm有機(jī)濾膜，供高效液相色譜測定。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

在GB 5009.121—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脫氫乙酸的測定》第二法的基礎(chǔ)上，分別對提取的時間、溫度、沉淀劑加入量和提取液pH進(jìn)行研究，初步確定各因素對脫氫乙酸提取量的影響程度和較佳提取條件。

1.3.2.1 提取時間

分別稱取若干份樣品各2 g于50 mL刻度離心管中，加入約10 mL水，加入5 mL硫酸鋅沉淀劑，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7.5，加水定容至25 mL，充分搖勻，于室溫下，分別超聲提取5，10，15，20，25和30 min后，以4 000 r/min離心5 min。取上清液過0.45 μm有機(jī)濾膜，供高效液相色譜測定。每個水平進(jìn)行2次平行試驗(yàn)。

1.3.2.2 提取溫度

分別稱取若干份樣品各2 g于50 mL刻度離心管中，加入約10 mL水，加入5 mL硫酸鋅沉淀劑，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)至pH 7.5，加水定容至25 mL，充分搖勻，在20，30，40，50，60，70和80 ℃下，超聲提取10 min后，以4 000 r/min離心5 min。取上清液過0.455 μm有機(jī)濾膜，供高效液相色譜測定。每個水平進(jìn)行2次平行試驗(yàn)。

1.3.2.3 沉淀劑加入量

分別稱取若干份樣品各2 g于50 mL刻度離心管中，加入約10 mL水，分別加入3，4，5，6和7 mL硫酸鋅沉淀劑，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)至pH 7.5，加水定容至25 mL，充分搖勻，于室溫下超聲提取10 min后，以4 000 r/min離心5 min。取上清液過0.455 μm有機(jī)濾膜，供高效液相色譜測定。每個水平進(jìn)行2次平行試驗(yàn)。

1.3.2.4 提取液pH

分別稱取若干份樣品各2 g于50 mL刻度離心管中，加入約10 mL水，加入5 mL硫酸鋅沉淀劑，用氫氧化鈉溶液或磷酸溶液調(diào)節(jié)pH分別為7.0，7.5，8.0，8.5，9.0，9.5和10.0，加水定容至25 mL，充分搖勻，于室溫超聲提取10 min后，以4 000 r/min離心5 min。取上清液過0.45 μm有機(jī)濾膜，供高效液相色譜測定。每個水平進(jìn)行2次平行試驗(yàn)。

1.3.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在前期單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取提取時間、沉淀劑加入量、提取液pH和提取溫度4個因素的3個較佳水平進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，重復(fù)3次，因素水平見表1。

表1 L9(34)正交試驗(yàn)因素水平表

1.3.4 脫氫乙酸的HPLC分析

利用高效液相色譜法測定蛋糕中脫氫乙酸含量。精確稱取25 mg脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)品，用20 g/L的氫氧化鈉溶解后，用水定容至25 mL，得到質(zhì)量濃度1.0 mg/mL的脫氫乙酸儲備液，用水稀釋制得質(zhì)量濃度1，2，5，10，20和50 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，與處理后的樣液一起進(jìn)高效液相色譜儀進(jìn)行分析測試。

液相色譜條件為：色譜柱，月旭XB C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相A 20 mmol/L乙酸銨（每升添加20 μL甲酸），B甲醇（A∶B=90∶10，V/V），等度洗脫；流速1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長293 nm，光譜采集范圍190～400 nm；進(jìn)樣量10 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 提取時間

如圖1所示，在5～15 min的時間段內(nèi)，隨著超聲時間的延長，脫氫乙酸提取量的增加幅度較大，從超聲5 min的0.173 g/kg增加到15 min的0.258 g/kg，而15 min后則呈現(xiàn)小幅增加，并趨于穩(wěn)定，這可能是由于在蛋糕基質(zhì)超聲過程中，在前15 min大量游離的脫氫乙酸被水溶液大量提取釋放出來，在15 min后由于超聲放熱，導(dǎo)致蛋糕的基質(zhì)溶脹，包裹在基質(zhì)里的少量脫氫乙酸被緩慢釋放出來，呈現(xiàn)小幅度增加。因此15 min為脫氫乙酸提取的最佳超聲時間。

圖1 超聲時間對脫氫乙酸提取量的影響

2.1.2 沉淀劑加入量

如圖2所示為沉淀劑加入量對脫氫乙酸提取效果的影響。沉淀劑加入量對結(jié)果的影響較小，沉淀劑加入量小于6 mL時，脫氫乙酸提取量處于相對穩(wěn)定的水平，沉淀劑加入量為7 mL時，脫氫乙酸提取量出現(xiàn)略微下降的情況，這可能由于沉淀劑的過量加入，導(dǎo)致基質(zhì)被沉淀劑覆蓋，無法完全提取；沉淀劑加入量為3 mL時，樣品在最后過膜時由于蛋白沉淀不徹底，導(dǎo)致阻力較大，容易造成濾膜穿透，樣液渾濁，考慮到經(jīng)濟(jì)環(huán)保的要求，又確保充分沉淀樣品中的蛋白，沉淀劑添加量5 mL較為合適。

圖2 沉淀劑加入量對脫氫乙酸提取量的影響

2.1.3 提取水浴溫度的影響

從圖3可以看出，隨著超聲波溫度增加，脫氫乙酸提取量不斷增大，溫度達(dá)到60 ℃后，提取結(jié)果趨于穩(wěn)定，說明隨著溫度提高，蛋糕基質(zhì)能更好地溶于提取液，有利于基質(zhì)中脫氫乙酸的提取，但溫度又不宜過高，否則影響試驗(yàn)的可操作性，因此提取溫度在50～70 ℃為宜。

圖3 水浴溫度對脫氫乙酸提取量的影響

2.1.4 提取液pH的影響

從圖4中可以看出，隨著提取液pH增加，脫氫乙酸提取量不斷變大，特別是pH達(dá)到8.5時，脫氫乙酸提取值先出現(xiàn)一個跳躍，后趨于穩(wěn)定，而pH 9.5時出現(xiàn)提取液過膜困難的情況，達(dá)到pH 10.0時，沉淀劑硫酸鋅與堿發(fā)生反應(yīng)而失效，提取液呈果凍狀，無法過膜。脫氫乙酸化合物呈酸性，在堿性環(huán)境中呈離子狀態(tài)，在水中的溶解度增大，更容易被提取出來，隨著pH增加，脫氫乙酸的提取量逐漸變大，但pH的增大容易損壞色譜柱，因此較佳的pH范圍為8.0～9.0。此外，在堿性的提取環(huán)境下，蛋糕基質(zhì)乳化劑中的油脂可能被皂化水解，減少樣品在提取過程中的乳化作用，有利于脫氫乙酸從基質(zhì)中釋放出來，增加提取量。

圖4 提取液pH對脫氫乙酸提取量的影響

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

基于單因素試驗(yàn)分析，進(jìn)行四因素三水平的正交分析試驗(yàn)，試驗(yàn)方案根據(jù)表1的因素與水平設(shè)計(jì)，采用極差分析法對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果見表2。由表2結(jié)果可以看出，各個因素對脫氫乙酸的提取效果影響的主次順序?yàn)镃＞D＞B＞A，即提取液pH＞提取溫度＞沉淀劑加入量＞提取時間，每個因素中當(dāng)K值最大為最佳試驗(yàn)組合，即A2B1C2D3，提取時間20 min、沉淀劑加入量4 mL、提取液pH 8.5、提取溫度70 ℃時，脫氫乙酸的提取效果最好。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)L9(34)提取優(yōu)化結(jié)果

3 實(shí)際樣品的測定

采用正交試驗(yàn)優(yōu)化后的最佳組合因素對3家不同生產(chǎn)廠家的3份蛋糕樣品中的脫氫乙酸含量進(jìn)行測定，相同的樣品同時按GB 5009.121—2016第二法進(jìn)行測定，將2種方法測定的結(jié)果與廠家的理論添加值進(jìn)行比較，具體結(jié)果見表3。

表3 試驗(yàn)方法、國標(biāo)方法與理論添加量的比較 單位：g/kg

采用優(yōu)化后的方法進(jìn)行測定的脫氫乙酸數(shù)值與3家廠商配方的理論添加量較為接近，而國標(biāo)方法測定的3組數(shù)值均只有理論添加量的40%左右，說明國標(biāo)方法在測定蛋糕中脫氫乙酸含量時結(jié)果存在較理論添加值普遍偏低的情況，需進(jìn)行適當(dāng)?shù)母倪M(jìn)。

4 結(jié)論

通過分析提取時間，提取溫度、提取液pH和沉淀劑加入量4個因素對蛋糕中脫氫乙酸提取的影響，并通過正交優(yōu)化試驗(yàn)得到最優(yōu)組合，結(jié)果表明當(dāng)提取時間20 min、沉淀劑加入量4 mL、提取液pH 8.5、提取溫度70 ℃時，脫氫乙酸的提取效果最好。采用最佳的試驗(yàn)條件對不同廠家的蛋糕中脫氫乙酸含量進(jìn)行測定，結(jié)果與理論添加劑值相符，說明該方法準(zhǔn)確度高，適用于蛋糕中脫氫乙酸含量的測定。