抗氧化和降膽固醇雙活性大麥若葉代餐羊酵乳的研制

白璐，王爽，秦鑫瑩，祝子翔，鄭可欣*，岳喜慶*

沈陽農業大學 食品學院（沈陽 110866）

人體內由自由基或活性氧引起的過氧化反應雖然具有抗病等必要功能，但是當它超出限度或在不當部位發生時即成為某些疾病的致病因子[1-3]，同樣，人體內的膽固醇是維持人體機能的必要組分，但是過高的膽固醇含量將引起動脈硬化和血栓等疾病[4-5]。因此，兩者都需要適當控制，而通過飲食控制機體內過氧化反應和膽固醇含量是最理想的方式。

大麥若葉為大麥生長到15～30 cm的幼苗[6]，富含微量元素、葉綠素、類黃酮、維生素、膳食纖維、多糖、蛋白質及抗氧化酶等多種功能營養成分[7-9]。近年來的研究表明，大麥若葉青汁不僅具有潤腸通便的功效，還具有較強的抗氧化和降膽固醇能力[8-9]，是新興的健康食材。

羊乳中乳清蛋白與酪蛋白的比例顯著高于牛乳，在胃內形成結構細小且松散的絮狀軟凝塊，易于被消化吸收，且羊乳含有少量的乳糖，與牛乳制品相比更適于乳糖酶缺乏的人群，顯著降低乳糖不耐受癥狀[10-11]。大量研究還表明，羊乳中的乳清蛋白及其降解形成的生物活性肽具有良好的調節血糖功能[12]。以羊乳為原料制成發酵乳，既能保留羊乳的營養成分，又增強其易被消化吸收的能力，更適宜乳糖不耐受人群[13-14]和2型糖尿病患者[12]。

研究以羊酵乳和大麥若葉粉為主，添加大麥若葉多糖、青稞、木薯粉、木糖醇和甜菊苷，制備具有抗氧化和降膽固醇的雙功能新型代餐羊酵乳。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

純山羊奶（弗里生天津乳制品有限公司）；大麥種子（壽禾種業）；木糖醇（鄭州市偉豐生物科技有限公司）；甜菊苷（鄭州市偉豐生物科技有限公司）；青稞（陜西北三禾食品有限公司）；木薯粉（海寧楓園食品有限公司）；酸奶發酵劑（尚川，10株菌型，廣東順德尚川科技有限公司）；無水乙醇（國藥，Cat#10009218）；正丁醇（西隴科學，Cat#71-36-3）；氯仿（阿拉丁，Cat# 865-49-6）；PBS磷酸鹽緩沖液（Solarbio，Cat#P1010）；鄰苯二甲醛（阿拉丁，Cat#643-79-8）；冰乙酸（國藥，Cat#64-19-7）；濃硫酸（國藥，Cat#7664-93-9）；新鮮雞蛋黃、膽固醇標準品（Merck，Cat#57-88-5）；考馬斯亮藍法蛋白濃度測定試劑盒（Mbchem，Cat#M2031）；總抗氧化能力檢測試劑盒（碧云天，Cat#S0119）。

1.2 儀器與設備

電子天平（島津AUW220D）；超凈工作臺（Thermo ScientificTMHeraguardTMECO 51029704）；低溫干燥機（雙嘉SJIA-10N-50C）；粉碎機（康和機械WF130）；超聲波細胞粉碎機（比朗BILON-1200Y）；恒溫水浴鍋（聚創世紀HH-6）；離心機（Thermo ScientificTMSorvall ST8R）；電磁爐（美的WH2202）；電熱恒溫培養箱（上海精宏DNP-9272）；pH計（上海雷磁PHS-3E）；冰箱（美菱YC-395L）；紫外分光光度計（Thermo Varioskan LUX）。

1.3 方法

1.3.1 大麥若葉代餐羊酵乳制作的工藝流程

市售生羊乳經巴氏殺菌后發酵獲得發酵乳，加入大麥若葉粉、大麥若葉多糖、木糖醇、甜菊苷和青稞木薯圓子，得到大麥若葉代餐羊酵乳產品，制備工藝流程如圖1所示。青稞木薯圓子由青稞搭配木薯粉和大麥若葉粉制備，用以提升產品咀嚼感和飽腹感。

圖1 大麥若葉代餐羊酵乳制作的工藝流程

1.3.2 操作要點

1) 大麥若葉粉制備：大麥種子在40 ℃溫水中浸泡24 h，挑除壞種后，均勻平鋪在加密盤上，覆蓋一張濕潤的育苗紙，放入培養箱。培養箱的培養條件：白天溫度（27±1）℃，晚上溫度（18±1）℃，光照時間16 h/d，光照強度2 000 Lx，濕度70%。保持每日噴水4～6次，等到種子長出1 cm的綠芽后揭開育苗紙，并在加密盤底部倒入蒸餾水，水位保持（3±0.1）cm。待麥苗長到20～30 cm進行收割，選取上端的大麥嫩葉，剔除蟲病害及污染的部分，用純凈水浸泡4～6 min，沖洗3次以上，去除灰塵及其他雜物，切成短桿狀（2 cm），用棉紙吸除表面水；稱取300 g大麥苗，以2 ℃/min的速度快速冷凍至-20 ℃，冷凍干燥微波功率設定為400 W，壓力設定為50 Pa，保持冷阱溫度在-40 ℃，干燥時間60 min。將冷凍的大麥苗用粉碎機粉碎（10 kW，10 min），經實驗篩網超細過濾得0.013 mm大麥若葉粉。

2) 大麥若葉多糖提取：稱取5.00 g大麥若葉粉，按照料液比1∶30 g/mL加入蒸餾水，超聲粉碎30 min，于70 ℃水浴加熱2 h，離心取上層清液，按照體積比3∶16加入乙醇（體積分數95%），冷藏12 h進行醇沉。采用Sevage法（V正丁醇∶V氯仿=4∶1）除蛋白，透析凍干得大麥若葉多糖。

3) 青稞木薯圓子制備：將青稞粒用純凈水浸泡5 h，在100 ℃沸水中煮4 h，冷卻至室溫后備用。取30 g木糖醇溶于清水（質量比為1∶5），熬煮至黏稠狀糖漿；取20 g大麥若葉粉、100 g木薯粉（可酌情適量增減）加入糖漿中，充分攪拌揉搓成面團，切分并壓成薄皮（0.3 g/個），每皮包裹一粒熟青稞，揉圓（直徑約7 mm）；于-18 ℃冷藏保存；制備成品前取青稞木薯圓子于沸水中煮15～20 min。

4) 羊酵乳的制備：生羊乳經巴氏殺菌并冷卻至室溫后，加入酸奶發酵劑（質量比為1∶500），充分攪拌，于42 ℃恒溫發酵10 h，室溫自然冷卻至10 ℃，放入4 ℃冰箱后熟12 h。

5) 大麥若葉代餐羊酵乳成品的制備：向羊酵乳中加入大麥若葉粉、大麥若葉多糖、木糖醇和甜菊苷后，充分攪拌，加入青稞木薯圓子即得到成品。

1.3.3 大麥若葉代餐羊酵乳組分的單因素試驗

用單因素試驗確定大麥若葉代餐羊酵乳的5個組分（因素），即大麥若葉粉、大麥若葉多糖、發酵菌接種量、木糖醇、青稞木薯圓子的適當添加數量，評價的方法為感官評定。

1) 大麥若葉粉添加量試驗：大麥若葉粉添加量分別為0.6，0.8，1.0和1.2 g/100 mL。不變組分為大麥若葉多糖添加量0.7 mg/mL、發酵菌接種量0.2 g/100 mL、木糖醇添加量3.4 g/100 mL、青稞木薯圓子添加量15%。

2) 大麥若葉多糖添加量試驗：大麥若葉多糖添加量分別為0.3，0.5，0.7和0.9 mg/mL。不變組分為大麥若葉粉添加量0.8 g/100 mL、發酵菌接種量0.2 g/100 mL、木糖醇添加量3.4 g/100 mL、青稞木薯圓子添加量15%。

3) 發酵菌接種量試驗：發酵菌接種量分別為0.15，0.20，0.25和0.30 g/100 mL。不變組分為大麥若葉粉添加量0.8 g/100 mL、大麥若葉多糖添加量0.7 mg/mL、木糖醇添加量3.4 g/100 mL、青稞木薯圓子添加量15%。

4) 木糖醇添加量試驗：木糖醇添加量分別為3.0，3.2，3.4和3.6 g/100 mL。不變組分為大麥若葉粉添加量0.8 g/100 mL，大麥若葉多糖添加量0.7 mg/mL，發酵菌接種量0.2 g/100 mL，青稞木薯圓子添加量15%。

5) 青稞木薯圓子添加量試驗：青稞木薯圓子添加量分別為5%，10%，15%和20%。不變組分為大麥若葉粉添加量0.8 g/100 mL、大麥若葉多糖添加量0.7 mg/mL、發酵菌接種量0.2 g/100 mL、木糖醇添加量3.4 g/100 mL。

1.3.4 大麥若葉代餐羊酵乳組分的正交試驗

根據單因素試驗確定的大麥若葉代餐羊酵乳5個組分的數量范圍，進行大麥若葉粉添加量（A）、大麥若葉多糖添加量（B）、發酵菌接種量（C）、木糖醇添加量（D）、青稞木薯圓子添加量（E）這5個因素4個水平的正交試驗，即按L16(45)進行正交設計（表1），通過感官評價，進行產品配方的優化。

表1 大麥若葉代餐羊酵乳組分優化正交試驗的因素和水平

1.3.5 產品的感官評定

選擇40名（男20名，女20名）評審人員組成感官評定小組，全部人員無不良生活習慣，無消化系統和內分泌系統疾病，一個月內沒有節食減肥及服用任何藥物。評審人員禁食5 h后飲用250 mL產品，15 min內進食完畢，分別從色澤、氣味、組織狀態、口感、飽腹感程度五個方面對大麥若葉代餐羊酵乳進行感官評分，評分標準如表2所示。

表2 感官評分指標

1.3.6 pH測定

用pH計測定產品pH。

1.3.7 抗氧化活性測定

以羊酵乳和純化大麥若葉多糖為對照組，以最優配方產品為試驗組，分別取1 mL溶于等體積磷酸鹽緩沖液（PBS）作為原液，依次進行2，4，8，16和32倍稀釋，利用總抗氧化能力試劑盒（ABTS法）進行抗氧化能力檢測。

1.3.8 降膽固醇活性測定

以羊酵乳為對照組，以最優配方產品為試驗組，分別取2 mL，調節pH至2.0，于4 000 r/min離心20 min，取0.04 mL上清液，利用鄰苯二甲醛吸附法測定膽固醇吸附量。計算公式：膽固醇吸附量（mg/g）=（吸附前蛋黃液中膽固醇含量-吸附后蛋黃液中膽固醇含量）/樣品質量。

2 結果與分析

2.1 大麥若葉代餐羊酵乳組分含量變化對感官評定的影響

2.1.1 大麥若葉粉添加量的影響

大麥若葉粉添加量對產品色澤、氣味和口感有較大影響。如圖2所示：當大麥若葉粉添加量為0.60 g/100 mL時，大麥若葉氣味淺淡，產品呈乳白色；添加量為0.80 g/100 mL時產品感官評分最高，產品呈淺綠色且色澤均勻，具有清新的大麥若葉香氣，口感細膩；而當添加量為1.00 g/100 mL時，大麥若葉氣味較濃且掩蓋住奶香味，口感略粗糙；當添加量為1.20 g/100 mL時產品整體呈墨綠色，出現沉淀，口味略苦。結果表明，當大麥若葉多糖添加量為0.7 mg/mL、發酵菌接種量為0.2 g/100 mL、木糖醇添加量為3.4 g/100 mL、青稞木薯圓子添加量為15%時，大麥若葉粉最適添加量為0.80 g/100 mL。

圖2 大麥若葉粉添加量對產品感官評定的影響

2.1.2 大麥若葉多糖添加量的影響

大麥若葉多糖添加量對產品感官評定略有影響。如圖3所示：當大麥若葉多糖添加量為0.70 mg/mL時，產品感官評分最高，此時產品色澤均一，質地均勻濃稠；當添加量高于0.70 mg/mL時，產品與多糖溶解度下降，出現結塊和分層現象，感官評分降低。結果表明，當大麥若葉粉添加量為0.8 g/100 mL、發酵菌接種量為0.2 g/100 mL、木糖醇添加量為3.4 g/100 mL、青稞木薯圓子添加量為15%時，大麥若葉多糖最適添加量為0.7 mg/mL。

圖3 大麥若葉多糖添加量對產品感官評定的影響

2.1.3 發酵菌接種量的影響

發酵菌接種量對產品組織狀態、氣味和口感有較大影響。如圖4所示：發酵菌接種量為0.20 g/100 mL時，產品感官評分最高，此時產品質地均勻，細膩黏稠，無分層結塊和乳清析出，酸度適宜；當接種量低于0.20 g/100 mL時，產品發酵不完全，出現分層現象，口感較差；當接種量高于0.20 g/100 mL時，產品乳清析出量明顯增多且有絮狀物生成，酸度增加，感官評分降低。結果表明，當大麥若葉粉添加量為0.8 g/100 mL、大麥若葉多糖添加量為0.7 mg/mL、木糖醇添加量為3.4 g/100 mL、青稞木薯圓子添加量為15%時，發酵菌最適接種量為0.20 g/100 mL。

圖4 發酵菌接種量對產品感官評定的影響

2.1.4 木糖醇添加量的影響

木糖醇添加量對產品口感有較大影響。如圖5所示：木糖醇添加量為3.40 g/100 mL時產品甜度適宜；隨著木糖醇添加量降低，產品酸度提升，口感下降；隨著木糖醇添加量逐漸提高，產品甜度急劇上升，甜膩感嚴重影響產品品質。結果表明，當大麥若葉粉添加量為0.8 g/100 mL、大麥若葉多糖添加量為0.7 mg/mL、發酵菌接種量為0.2 g/100 mL、青稞木薯圓子添加量為15%時，木糖醇最適添加量為3.40 g/100 mL。

圖5 木糖醇添加量對產品感官評定的影響

2.1.5 青稞木薯圓子添加量的影響

青稞木薯圓子添加量對產品飽腹感有較大影響。如圖6所示：當青稞木薯圓子添加量為15%時，產品飽腹感最強且飽腹程度適宜，該比例對酸奶本身口感無影響，但較強地增加了評價者的咀嚼感及飲用趣味；隨添加量降低，評價者飽腹感程度呈明顯下降趨勢；當添加量大于15%時，部分評價者開始出現咀嚼困難和胃部飽脹的情況。結果表明，當大麥若葉粉添加量為0.8 g/100 mL、大麥若葉多糖添加量為0.7 mg/mL、發酵菌接種量為0.2 g/100 mL、木糖醇添加量為3.4 g/100 mL時，青稞木薯圓子最適添加量為15%。

圖6 青稞木薯圓子添加量對產品感官評定的影響

2.2 大麥若葉代餐羊酵乳配方優化試驗結果

大麥若葉粉添加量（A）、大麥若葉多糖添加量（B）、發酵菌接種量（C）、木糖醇添加量（D）和青稞木薯圓子添加量（E）的5個因素4個水平的正交試驗結果如表3所示。在5個因素中，影響大麥若葉代餐羊酵乳感官品質的次序為大麥若葉粉添加量（A）＞木糖醇添加量（D）＞發酵菌接種量（C）＞青稞木薯圓子添加量（E）＞大麥若葉多糖添加量（B）。產品最優生產工藝為A2B3C2D3E3，即大麥若葉粉添加量0.8 g/100 mL，木糖醇添加量3.4 g/100 mL，發酵菌接種量0.2 g/100 mL，青稞木薯圓子添加量15%，大麥若葉多糖添加量0.70 mg/mL。按照最優組合制備的大麥若葉代餐羊酵乳產品的感官評分95分，顯著高于其他組合。

表3 正交試驗結果

2.3 大麥若葉代餐羊酵乳的抗氧化活性

2, 2-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）在氧化劑作用下被氧化成綠色的ABTS+自由基，測定體系在734 nm處的吸光度；當體系中存在抗氧化劑時，能夠抑制該氧化反應的發生，并降低反應體系在734 nm處的吸光度[15]。試驗以Trolox（1 mmol/L）溶液為標準抗氧化劑，比對檢測純羊酵乳、大麥若葉多糖及大麥若葉代餐羊酵乳的抗氧化能力，結果如圖7所示。純羊酵乳抗氧化能力較低，僅為1.99±0.014 mmol/L Trolox，純化大麥若葉多糖抗氧化能力為2.475±0.035 mmol/L Trolox，顯著高于純羊酵乳（p＜0.005）。大麥若葉青汁代餐羊酵乳的抗氧化能力為2.41±0.014 mmol/L Trolox，與純化大麥若葉多糖相近，顯著高于純羊酵乳（p＜0.005）。這個結果說明大麥若葉代餐羊酵乳具有較強的抗氧化能力。

圖7 大麥若葉代餐羊酵乳的抗氧化能力

2.4 大麥若葉代餐羊酵乳的降膽固醇活性

在濃硫酸的作用下，鄰苯二甲醛（O-phthalaldehyde，OPA）上的醛基（—CHO）能與膽固醇的C3位上的羥基（—OH）相互吸附產生紫紅色物質，在波長550 nm處有最大吸光度[16]，當體系中存在膽固醇吸附物質時，OPA與膽固醇形成的紫色物質減少，降低在550 nm處的吸光度。因此，OPA可用于檢測反應體系中的膽固醇含量。研究中，以新鮮雞蛋黃液為膽固醇供體，經純羊酵乳和大麥若葉代餐羊酵乳分別吸附后，用OPA檢測體系中的膽固醇含量變化，結果如圖8所示。純羊酵乳對膽固醇吸附量較低，僅為1.35±0.212 mg/g，大麥若葉代餐羊酵乳的膽固醇吸附量為2.5±0.141 mg/g，顯著高于純羊酵乳（p＜0.000 5）。這個結果表明，大麥若葉代餐羊酵乳比純羊酵乳具有更強的膽固醇吸附能力。

圖8 大麥若葉代餐羊酵乳的降膽固醇活性

3 結論

根據單因素試驗和正交試驗結果綜合分析得出，大麥若葉代餐羊酵乳最優配方為大麥若葉粉添加量0.8 g/100 mL，大麥若葉多糖添加量0.70 mg/mL，木糖醇添加量3.4 g/100 mL，甜菊苷添加量0.01 g/100 mL，混合發酵菌接種量0.2 g/100 mL，青稞木薯圓子添加量15%。原奶經巴氏殺菌后發酵調配，發酵時長10 h，加入其他組分后，乳酸菌數≥109CFU/mL，未檢出大腸桿菌，符合GB 19302—2010《發酵乳》[17]。該產品不僅含有豐富的乳蛋白，還具有抗氧化和降膽固醇的雙活性，且不影響產品的品質。大麥若葉代餐羊酵乳的研制豐富了羊乳加工食品和代餐產品種類，擴展了大麥若葉的用途，同時為抗氧化和降膽固醇功能性食品的研發提供了新思路。