酶法制備高含量多不飽和脂肪酸甘油三酯的工藝

馬良，張延秀*，范書琴，張建全，曲亭和，王坤

山東禹王制藥有限公司（禹城 251200）

魚油中富含ω-3多不飽和脂肪酸，尤其是二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA），具有改善視力、抗疲勞、降血脂、有助于大腦發育、增強免疫力等多種生理功能。目前市場上銷售的魚油產品主要為乙酯型和甘油三酯型兩種，甘油三酯型是魚油中EPA和DHA的天然存在形式，與乙酯型魚油相比，甘油三酯型魚油具有生物利用度高[1-2]、吸收率高[3-4]、穩定性高[5-7]等優點。甘油三酯型魚油不但是EPA和DHA的天然存在形式，而且具有易于被人體吸收、食用安全、口感好、性質穩定、品質高等優點，隨著人們對健康的重視程度越來越高，全球精制魚油的需求量越來越大。

甘油酯型多不飽和脂肪酸產品作為藥品在經濟發達國家應用日益廣泛，其制備方法主要有化學法、物理法和酶法[8-9]。國內多采用傳統化學工藝生產甘油三酯型多不飽和脂肪酸，存在高能耗、溶劑殘留等缺點。近年來，酶法制備因其具有反應效率高、專一性強[10]、反應條件溫和、選擇性高、環境友好、能耗低等特點而引起人們的重視。脂肪酶是一類具有多種催化能力的酶，可以催化三酰甘油酯及其他一些不溶性酯類的水解、醇解、酯化、轉酯化及酯類的逆向合成反應。試驗采用脂肪酶，催化乙酯型魚油轉化為甘油三酯型魚油。通過單因素試驗、正交試驗優化影響脂肪酶催化甘油三酯型魚油轉化率的酶添加量、底物摩爾比、反應溫度、反應時間等因素，得到優化后的反應條件，并形成一條可產業化的工藝路線。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脂肪酶（假絲酵母脂肪酶）；甘油（煙臺鴻和生物科技有限公司）；乙酯型魚油（山東禹王制藥有限公司）。

1.2 主要儀器與設備

HCJ-4E恒溫水浴鍋（常州恩誼儀器制造有限公司）；D2004W磁力攪拌器（上海司樂儀器有限公司）；SHB-III真空泵（北京神泰偉業儀器設備有限公司）；1200高效液相色譜儀[安捷倫科技（中國）有限公司]。

1.3 檢測

1.3.1 樣品制備

用電子天平準確稱取約50 mg樣品加入10 mL容量瓶中，用四氫呋喃溶解、稀釋并定容至刻度。

1.3.2 分析條件

色譜柱Phenogel，5 μm 100A，300 mm×7.8 mm，50 nm；流動相為四氫呋喃，流速0.8 mL/min；甘油酯含量計算采用面積歸一法。

2 結果與討論

2.1 單因素試驗

2.1.1 底物摩爾比對乙酯轉化率的影響

選取底物摩爾比（乙酯型魚油和甘油）1∶1，2∶1，3∶1，4∶1和5∶1，酶添加量1%，溫度45℃，考察底物摩爾比對乙酯轉化率的影響。如圖1所示，隨著底物摩爾比增大，乙酯轉化率逐漸升高，但是當底物摩爾比超過3∶1時，乙酯轉化率變化趨勢變緩，考慮成本，選擇底物摩爾比3∶1，此時乙酯轉化率可達60%。

圖1 底物摩爾比對乙酯轉化率的影響

2.1.2 酶添加量對乙酯轉化率的影響

選取酶添加量1%，2%和3%，底物摩爾比3∶1，溫度45 ℃，考察酶添加量對乙酯轉化率的影響。

由圖2可以看出，酶添加量對達到反應平衡的速度有重要影響，合適的酶添加量能使反應體系快速達到平衡。隨著酶添加量增加，乙酯轉化率也逐漸增大；但酶添加量大于2%時，隨著酶添加量增加，乙酯轉化率變化不大。隨著反應體系中酶加量增加，反應底物與催化劑酶分子之間接觸機會增多，乙酯轉化率也隨之增大，但反應體系中酶濃度很大時，添加酶對酯交換反應并不產生顯著影響，而且添加酶會導致成本的增加，基于成本和經濟條件考慮，酶添加量選擇2%。

圖2 酶添加量對乙酯轉化率的影響

2.1.3 反應溫度對乙酯轉化率的影響

選取反應溫度40，45，50和55 ℃，底物摩爾比3∶1，酶添加量2%，考察反應溫度對乙酯轉化率的影響。

由圖3可以看出，反應溫度小于50 ℃，乙酯轉化率隨溫度升高而增大，溫度大于50 ℃時，乙酯轉化率小幅下降，這是因為溫度小于50 ℃時，隨著溫度升高，底物溶解性增加使反應程度增大，乙酯轉化率增加，但是較高的反應溫度，可能會使脂肪酶失活，由于多不飽和脂肪酸屬于熱敏性物質，在較高溫度下反應一段時間，可能部分會發生氧化、降解等反應，影響其反應效果，導致乙酯轉化率降低。綜合考慮反應速度、能耗及酶的操作穩定性，選擇溫度50 ℃為宜。

圖3 反應溫度對乙酯轉化率轉化率的影響

2.1.4 反應時間對乙酯轉化率的影響

選取反應時間5，10，15，20和25 h，溫度50℃，底物摩爾比3∶1，酶添加量2%，考察反應時間對乙酯轉化率的影響。

由圖4可以看出，隨著反應時間延長，乙酯轉化率逐漸提高，但反應時間超過15 h后，乙酯轉化率無明顯變化，因此反應時間選擇15 h。

圖4 反應時間對乙酯轉化率的影響

2.2 正交試驗

在單因素試驗基礎上，選定四因素三水平作酶法催化多不飽和脂肪酸乙酯制備多不飽和脂肪酸甘油三酯工藝優化的正交試驗，見表1。極差數據分析表明，影響乙酯轉化率的主次關系依次是底物摩爾比、反應溫度、反應時間、酶添加量。結果表明，最佳工藝參數為底物摩爾比3∶1、酶添加量3%、反應溫度55 ℃、反應時間15 h。

表1 正交試驗結果

3 結論

試驗用脂肪酶催化多不飽和脂肪酸乙酯制備多不飽和脂肪酸甘油三酯，分別探討底物摩爾比、酶添加量、反應溫度和反應時間對乙酯轉化率的影響，并在單因素試驗基礎上，通過正交試驗得出酶法制備多不飽和脂肪酸甘油三酯的最佳工藝參數：底物摩爾比3∶1，酶添加量3%，反應溫度55 ℃，反應時間15 h。試驗結果為可產業化工藝路線的形成提供參考。