大孔樹脂串聯(lián)富集沙漠肉蓯蓉苯乙醇苷的工藝

向玲，陳一鳴，王松濤，陳泳潔，李姝，焦威*

1. 中國科學院成都生物研究所天然產物研究中心（成都 610000）；

2. 瀘州品創(chuàng)科技有限公司（瀘州 646000）；3. 川北醫(yī)學院藥學院（南充 637000）

肉蓯蓉原植物為列當科植物肉蓯蓉屬的寄生植物，全世界約20種，我國有6種及1變種，分別為肉蓯蓉（Cistanche deserticolaY. C. Ma.）、鹽生肉蓯蓉[C.salsa（C. A. Mey）G. Beck]、管花肉蓯蓉[C.tubulosa（Schenk）R. Wight]、沙蓯蓉（C.sinensisG. Beck）、蘭州肉蓯蓉（C.lanzhouensisZ. Y. Zhang）、迷肉蓯蓉[C.ambigua（Bge.）G. Beck]和1變種白花鹽蓯蓉（C.salsa var. albiflor P. F. Tuet Z. C. Lou）[1-2]。主要分布于北緯36°～37°，東西橫跨我國內蒙古、陜西、甘肅、青海、寧夏及新疆等省區(qū)[3]。在我國，肉蓯蓉擁有悠久的藥食兩用歷史[4]，肉蓯蓉藥用功效最早記載于《神農本草經》，強調有補五臟，強陰益精氣，益髓補中之功。被廣泛應用于治療腎陽虛、經血虧虛、陽痿不孕等疾病。具有溫而不熱，補而不峻的特點，適合長期服用。肉蓯蓉食療養(yǎng)生最早記載于唐代的《本草拾遺》，而《本草經集注》《藥性論》[5-6]記載具體的使用方法，其配料多以羊肉為主，以作羊肉羹。到明代，食用方法更加豐富，有煲湯、熬粥、燉、炒、煮等。到了現代，隨著對肉蓯蓉的不斷深入研究，人們對肉蓯蓉中的成分提取方法進行研究[7-8]，提取的成分中主要含有苯乙醇苷類[9]、糖類[10]等多種生物活性，有預防神經保護作用[11]，預防骨質疏松[12]、血管性癡呆[13]，以及通便作用[14]、滋陰補陽[15]等，證明其無毒副作用，服用安全可靠。不僅在醫(yī)學上被廣泛應用，而且在食品發(fā)展中也不斷深入，如肉蓯蓉發(fā)酵酒的工藝技術[16]，肉蓯蓉的營養(yǎng)保健[17]，復合肉蓯蓉固體飲料制粒工藝[18]等。

試驗不僅優(yōu)化適合工業(yè)生產的肉蓯蓉提取方法，而且將大孔樹脂串聯(lián)富集方法用于肉蓯蓉有效成分純化的研究。該工藝簡單可行、分離效果好，能很好地保留有效成分，降低色素含量，適用于肉蓯蓉苯乙醇苷的連續(xù)工業(yè)化生產，為工業(yè)生產高含量苯乙醇苷提取物提供參考，期望應用于食品發(fā)展方向。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

肉蓯蓉2019年購于內蒙古阿拉善盟，經鑒定為列當科（Orobanchaccae）肉蓯蓉屬（Cistanche）植物荒漠肉蓯蓉（Cistanche deserticolaY. C. Ma.），肉蓯蓉橫切面見圖1，干燥，粉碎。松果菊苷標準品（批號PS000867，純度＞99%，成都普思生物科技股份有限公司）；大孔樹脂AB-8、ADS-7（天津浩聚樹脂科技有限公司）；蒸餾水（實驗室自制，成都品成科技有限公司）；無水乙醇（分析純，成都金山化學試劑有限公司）；甲醇（HPLC級，上海星可高純溶劑有限公司）。

圖1 荒漠肉蓯蓉橫切面圖

1.2 儀器與設備

LC-16分析型高效液相色譜儀（日本SHIMADZU）；XD-5203型旋轉蒸發(fā)器（上海賢德實驗儀器有限公司）；B-260型恒溫水浴鍋（上海賢德實驗儀器有限公司）；CCA-20型低溫冷卻液循環(huán)泵（鞏義市予華儀器有限責任公司）；SHZ-D111型循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限責任公司）；JA1203型精密電子天平（上海良平儀器儀表有限公司）；XTP-500A型高速多功能粉碎機（浙江省永康市紅太陽機電有限公司）。

2 試驗方法與結果討論

2.1 標準曲線

2.1.1 檢測方法的建立

試驗檢測采用HPLC檢測。對樣品做紫外全波段掃描，結果顯示樣品在315～335 nm之間有最大吸收峰。色譜條件：以0.5%醋酸為流動相A，乙腈為流動相B，流速1.0 mL/min，柱溫35 ℃，檢測波長333 nm，進樣量5 μL。

2.1.2 標準品的制備

精密稱取10 mg松果菊苷對照品置于燒杯中，加入甲醇溶解后轉入10 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，充分振蕩溶解，即配制成1 mg/mL的對照品溶液。

2.1.3 標準曲線的制備

分別精密移取5，10，15和20 μL上述對照品溶液進樣，按照上述色譜條件進行測定，以松果菊苷進樣量為橫坐標，測得的峰面積為縱坐標繪制標準曲線，并計算回歸方程，所得回歸方程為y=（7×106）x-393 095（R2=0.994 8），在0～18 μg范圍內呈良好線性關系。

2.1.4 樣品含量測定

分別精密吸取5 μL對照品溶液與供試品溶液，注入液相色譜儀，測定，HPLC色譜圖如圖2和圖3所示，富集純化后肉蓯蓉提取物如圖4所示。

圖2 對照品HPLC圖

圖3 藥材HPLC圖

圖4 純化產品HPLC圖

2.2 荒漠肉蓯蓉中苯乙醇苷類的提取工藝優(yōu)化試驗

2.2.1 正交試驗的設計

考慮實際提取條件，基于預試驗，使用熱回流提取方法提取，選用70%乙醇溶液[2]為提取媒介，考察影響荒漠肉蓯蓉中苯乙醇苷類提取的3個主要因素，即料液比、溫度、時間的最佳參數，對單個因素分別考察選出合適范圍，從每個因素各取3個水平，因素水平安排見表2。

表1 色譜條件梯度表

表2 正交試驗因素水平

2.2.2 統(tǒng)計方法

采用SPSS 13軟件正交設計分析方法。

2.2.3 試驗結果

正交試驗結果見表3。通過對表3數據進行分析，根據K值大小，最優(yōu)水平為A1B2（B3）C1，即提取溶液采用70%乙醇，溫度70 ℃下，每次1.5 h，料液比1∶10（g/L） 或提取溶液采用70%乙醇，溫度70 ℃下，每次2 h，料液比1∶10（g/L）。從目標峰提取率來看，提取率在3%以上的提取時間均為2 h，說明提取時間對苯乙醇苷類的影響較大。

表3 正交試驗設計和結果

2.3 荒漠肉蓯蓉中苯乙醇苷類的純化工藝考察

為使提取出來的有效成分能夠應用于食品生產中，需在重點清除色素與淀粉的同時，盡可能保留有效成分。采用大孔吸附樹脂作為填料。

2.3.1 大孔樹脂選擇

常規(guī)富集主要采用AB-8型大孔樹脂，弱極性的AB-8型大孔樹脂對肉蓯蓉有效成分具有很好的富集效果。肉蓯蓉有效成分主要為苯乙醇苷類，苯乙醇苷類在水溶液中可以很好地被AB-8型大孔樹脂吸附分離。AB-8型大孔樹脂采用條件：藥材與樹脂比1∶1，浸膏水溶解后上樣，將洗脫液二次上樣，分別用0，20%，40%和50%的乙醇。目標物在乙醇體積分數50%以下，若體積分數過高就有一些脂類物質被沖出，將收集得到的含有目標物的洗脫液濃縮進行二次吸附。

由于大孔樹脂ADS-7具有很好的分離色素的能力，這對于應用到食品方向有著重要意義。采用AB-8型大孔樹脂的研究方式類比到ADS-7型大孔樹脂，對ADS-7型大孔樹脂進行最優(yōu)條件的探索，分為靜態(tài)吸附、動態(tài)吸附與解吸試驗。將2種樹脂串聯(lián)使用研究承載量和不同洗脫濃度的松果菊苷含量。

2.3.2 靜態(tài)吸附試驗

將5 g浸膏濃縮干燥，通過超聲混合均勻配制成20 mg/mL的浸膏水溶液，測定各組分含量。準確稱取2 g共5份ADS-7型大孔樹脂置于50 mL三角燒瓶中，混合均勻后的浸膏水溶液準確量取50，25，16.65，12.5和10 mL，加入到三角燒瓶中，依次標好標簽，分別為樹脂與藥材比1∶1，2∶1，3∶1，4∶1和5∶1，瓶口密封靜置24 h后，過濾將樹脂洗凈收集并濃縮濾液分別溶解在50.00，25.00，16.65，12.50和10.00 mL的純水中，測定各組分含量。運用式（1）計算吸附率。

式中：A為吸附率，%；Cq為吸附前溶液中松果菊苷含量，mg/mL；Ch為吸附后溶液中松果菊苷含量，mg/mL。

各個試驗組經過HPLC液相檢測，通過計算標準品松果菊苷的含量變化確定承載量，吸附前松果菊苷的含量對應的峰面積143 966。通過式（2）計算吸附率。計算結果如表4和圖5所示。結果顯示當樹脂與藥材比達到4∶1及以上，吸附率以及吸附效果可觀。

圖5 ADS-7型大孔樹脂吸附率圖

表4 ADS-7型大孔樹脂吸附率表

式中：A為吸附率，%；Cq為吸附前溶液中松果菊苷含量，mg/mL；Ch為吸附后溶液中松果菊苷含量，mg/mL。

2.3.3 動態(tài)吸附與解吸試驗

將AB-8型大孔樹脂和ADS-7型大孔樹脂凈品級用純水濕法裝柱，檢驗AB-8型大孔樹脂最優(yōu)條件：藥材與樹脂比1∶1，浸膏水溶解后上樣，將洗脫液二次上樣，使各組分充分吸附。用不同體積分數的乙醇洗脫，分別為0，20%，40%和50%。目標物在乙醇體積分數50%以下。

ADS-7型大孔樹脂按照樹脂與藥材比4∶1上樣，經過對上樣質量濃度，以及洗脫劑濃度的探究，并按式（3）和式（4）計算，得到表5和表6。

表5 ADS-7動態(tài)吸附數據表

表6 ADS-7動態(tài)解吸數據表

式中：A為吸附率，%；Cq為吸附前溶液中松果菊苷含量，mg/mL；Ch為吸附后溶液中松果菊苷含量，mg/mL。

式中：B為解吸率，%；Cq為吸附前溶液中松果菊苷含量，mg/mL；Ch為吸附后溶液中松果菊苷含量，mg/mL；Cj為解吸后松果菊苷的含量，mg/mL。

從數據可以看出，最佳上樣質量濃度為18 mg/mL，50%乙醇溶液洗脫效果最好。

通過標準曲線計算，獲得表7。

表7 松果菊苷富集率表

綜上所述，對于有效成分的富集，可以先用純水將無法吸附的雜質清除干凈，后換用50%的乙醇溶液洗脫富集。富集條件相同但AB-8型大孔樹脂與ADS-7型大孔樹脂存在差異，AB-8型大孔樹脂富集效果更好，但是色素分離效果不及ADS-7型大孔樹脂優(yōu)秀。

2.3.4 樹脂串聯(lián)試驗

由于一次富集除雜效果不好，所以需要將第1次富集的有效成分進行二次洗脫富集，2次全部選用AB-8型大孔樹脂色素分離情況不佳，若2次全部選用ADS-7型大孔樹脂有效成分富集情況不及AB-8型優(yōu)秀，為適合產品效果，將提取的粗浸膏先通過AB-8型大孔樹脂進行富集，后經過ADS-7型大孔樹脂進行二次富集。2次富集均采用2.3.3中最優(yōu)條件，采用2.1.1中的檢測方法檢測。

結合表8～表10數據，若2次全部選用AB-8型大孔樹脂色素，分離情況不佳，但富集效果好，若2次全部選用ADS-7型大孔樹脂，有效成分富集情況不及AB-8型優(yōu)秀，但具有良好的除色效果。所以將樹脂串聯(lián)，串聯(lián)后對有效成分有較好的富集效果，對色素也有很好的清除效果，產物金黃色且澄清透明。

表8 串聯(lián)試驗富集率

表9 AB-8 2次富集率

表10 ADS-7 2次富集率

綜上所述可以得到樹脂串聯(lián)條件：AB-8型大孔樹脂、ADS-7型大孔樹脂與藥材比分別為1∶1∶1；先通過AB-8富集50%的組分，后通過ADS-7富集50%的組分。這種富集方法既可以避免2次都是用ADS-7型大孔樹脂對有效成分的大量消耗，又可以解決只使用AB-8型大孔樹脂難以分離色素的問題。

3 結論

對有望應用在食品方向上肉蓯蓉有效成分提取富集的工藝進行研究設計。試驗通過大孔樹脂的方法對肉蓯蓉的苯乙醇苷進行提取純化，通過靜態(tài)吸附、動態(tài)吸附與解吸，對上樣質量濃度、上樣體積、洗脫液濃度進行研究，比較AB-8型樹脂、ADS-7型樹脂和AB-8型樹脂串聯(lián)ADS-7型樹脂的富集率，試驗確定肉蓯蓉苯乙醇苷類純化最佳工藝：AB-8和ADS-7型大孔樹脂串聯(lián)的方法富集有效成分，先使用AB-8型大孔樹脂富集樹脂與藥材質量比1∶1上樣，50%乙醇洗脫液；后使用ADS-7型大孔樹脂進行二次富集，樹脂與藥材質量比4∶1上樣，50%乙醇洗脫。試驗優(yōu)化了提取工藝溫度，更適合工業(yè)生產條件；同時探究既能有效富集肉蓯蓉有效成分，又能有效減少色素的大孔樹脂串聯(lián)方法。該純化工藝操作簡單，周期較短，富集率高，減少雜質，為肉蓯蓉藥食兩用的開發(fā)應用提供可靠方向。