miR-33b、miR-3195在喉鱗狀細胞癌組織中的表達及與臨床病理特征的相關性

王軍玉 邵路軍

1 河南省長垣市中醫醫院耳鼻喉科 453400； 2 鄭州博愛眼耳鼻喉醫院麻醉科

喉鱗狀細胞癌為耳鼻喉外科高發惡性腫瘤，近年來喉癌發病率呈逐年上升趨勢。隨著手術方式不斷改進與放化療等方式輔助治療，喉鱗狀細胞癌治療確定一定進展，但患者預后仍不佳，特別是晚期患者預后較差。故深入了解喉鱗狀細胞癌發病機制，通過篩選腫瘤相關特異性標志物可為早期診斷發現腫瘤并治療提供參考依據，為目前臨床亟需解決的難題[1-2]。 微小RNA為近年來發現的非編碼短序列的小RNA，長度在18～25個核苷酸，成熟miR與靶基因mRNA完全或不完全互補配對，降解或沉默靶基因，具有類似癌基因和抑癌基因作用。miR分子為早期癌癥檢測的標記分子，能早期診斷預測腫瘤疾病發生，對診斷喉鱗狀細胞癌并判斷患者預后具有重要價值[3]。microRNA為轉錄后水平調節編碼蛋白基因表達內源性非編碼RNA分子，研究顯示[4]，miR-33b與miR-3195在惡性腫瘤中異常表達。為此，本研究通過對68例喉鱗狀細胞癌患者癌組織與癌旁組織的miR-33b、miR-3195表達情況進行對比，并經相關性分析miR分子表達與臨床病理參數關系，旨在為判斷患者預后提供參考依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 經醫院醫學倫理委員會批準，回顧性分析選取長垣市中醫醫院2018年10月—2020年10月收治的68例喉鱗狀細胞癌患者，手術取喉鱗狀細胞癌組織與癌旁正常組織。納入標準：符合《口腔鱗狀細胞癌時辰化療中國專家共識》標準[5]，且手術后經病理檢查確診為喉鱗狀細胞癌；術前無放化療等抗腫瘤治療；簽署知情同意書。排除標準：合并其他惡性腫瘤患者；肝腎等臟器衰竭患者；免疫系統疾病患者；傳染性疾病患者；精神疾病及意識障礙患者；凝血功能障礙患者。納入患者中男58例，女10例；年齡48～72歲，平均年齡(68.48±7.29)歲；組織分化程度：低分化21例、中分化28例、高分化19例；臨床TNM分期：T1期16例、T2期20例、T3期23例、T4期9例；腫瘤類型：聲門型37例、聲門上型17例、聲門下型14例；淋巴結轉移情況：轉移29例、無轉移39例。

1.2 方法 (1)RNA提取：①取喉鱗狀細胞癌組織與對應癌旁正常組織，于液氮下研成粉末，刮入EP管中；②管內分別加入裂解液充分混勻，于室溫下靜置；③管內加入氯仿，EP管上下顛倒數次，當其溶液變為乳白色后，靜置10min；④使用離心機進行離心，靜置，EP管內分成3層，上層液相中含有RNA；⑤將上清液移到新的EP管內，加入異丙醇，于低溫下沉淀，后離心5min；⑥加入預冷乙醇，上下顛倒后離心；⑦棄除上清液干燥的RNA沉淀，加入DEPC水混勻，于室溫下溶解。采用分光光度儀(上海儀電分析儀器有限公司，型號：N2S/N2)檢測RNA的純度，良好RNA的OD260/OD280位于1.8～2.0，該數值表明RNA純度合格。(2)逆轉錄：①于PCR管內配置逆轉錄反應體系；②配置PCR體系，振蕩混勻后離心，在低溫冰盒上操作，管內先后加入DNA模板與引物，加入MIX體系，待無氣泡產生后將PCR管放入PCR儀器中，逆轉錄體系中于37℃中保溫使其完全反應后放置85℃中終止反應;③向體系中加入ddH2O進行稀釋，放置冰箱內保存待用。(3)PCR檢測：①配置反應體系；②配置PCR反應條件：95℃進行15min預變，進入循環后，于94℃變性15s，55℃退火30s，70℃延伸30s，對熒光進行采集，共40循環；于60～95℃下融解，內參設為U6，重復進行3次試驗，采用2-ΔΔCT，ΔΔCT=(Ct目標基因-Ct管家基因)研究組-(Ct目標基因-Ct管家基因)對照組，計算相對定量法檢測miR-33b、miR-3195表達量[6-7]。

1.3 統計學方法 采用SPSS20.0軟件分析數據，計數資料以χ2檢驗，符合正態分布的定量資料分析采用t檢驗和方差分析，相關性的分析采用Spearman秩相關方法；以P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組miR-33b、miR-3195表達水平比較 喉鱗狀細胞癌組織中miR-33b、miR-3195表達量低于癌旁組織(P<0.05)。見表1。

表1 兩組織 miR-33b、miR-3195表達水平比較

2.2 癌組織 miR-33b、miR-3195表達與臨床病理特征關系 喉鱗狀細胞癌組織中miR-33b、miR-3195表達量與性別、年齡無關(P>0.05)，與組織分化程度、TNM分期、腫瘤部位及淋巴轉移有關(P<0.05)。見表2。

表2 癌組織 miR-33b、miR-3195表達與臨床病理特征關系

2.3 癌組織miR-33b、miR-3195表達與病理特征相關性分析 經Spearman相關性分析結果顯示，喉鱗狀細胞癌患者miR-33b、miR-3195表達與TNM分期、淋巴結轉移呈負相關(P<0.05)。見表3。

表3 癌組織 miR-33b、miR-3195表達與病理特征相關性分析

3 討論

喉鱗狀細胞癌為頭頸部常見惡性腫瘤，發病率在全身惡性腫瘤中占有一定比率。該腫瘤分為聲門型、聲門上型與下型三種類型，其中聲門型最常見，男性發病率高于女性。近年來喉鱗狀細胞癌發病率逐漸上升，認為該腫瘤的發生發展為多因素多步驟綜合作用結果，但具體發病原因尚不明確。目前臨床治療喉鱗狀細胞癌的方式有手術、放化療、基因等治療，患者在早期能通過多種方式進行治愈，對于晚期患者的療效較差[8-9]。故探討有效檢測指標及預后指標以制定合理高效的治療方法對提高患者生活質量并延長生存時間極為重要。

微小RNAs在轉錄后水平調控mRNA表達，但無蛋白質編碼功能，長度在19～25個核苷酸，為一類單鏈小分子RNA，可經多種途徑影響生物體生命過程。與多種長鏈非編碼RNA相比，miRNA在人類基因組中占比較低，但部分基因可通過與miRNA結合而受其調控。研究顯示，大多數miRNA位于染色體腫瘤相關部位[10-11]。隨著近年來對惡性腫瘤發病相關機制不斷深入研究，發現miRNA在喉鱗狀細胞癌等多種惡性腫瘤中存在異常表達，說明了miRNA可能促進或抑制腫瘤發展，與其發生發展具有一定關系。miR-33b為miR-33家族成員，能調節膽固醇穩態及脂質、糖類代謝功能。有研究指出[12]，miR-33b能抑制乳腺癌細胞干細胞特性、轉移與侵襲，發揮抑癌作用。在喉鱗狀細胞癌中miR-33a能通過直接靶向PIM-1原癌基因3’端非翻譯區發揮抗增殖功能，在多種惡性腫瘤中表達下調，為抑癌基因。miR-3195位于20號染色體的q13.33上，前體于miRBase中編號為MI0014240；成熟miR-3195于miRBase中編號為MIMAT0015079。20號染色體上microRNA與胃癌、肝癌、大腸癌等惡性腫瘤發病密切相關，進一步研究顯示20q13.33與造血系統的惡性腫瘤有關[13]。芯片篩選實驗結果顯示[14]，喉鱗狀細胞癌標本中存在較多上調或下調表達的miRNA，說明miRNA表達量變化在喉鱗狀細胞癌發生發展過程中具有關鍵作用。本研究中基因芯片檢測與PCR檢測結果顯示在喉鱗狀細胞癌組織中miR-33b、miR-3195相對表達量均低于癌旁正常組織，可能是miR-33b、miR-3195在喉鱗狀細胞癌中發揮類似癌基因的作用[14]。相對于癌旁正常組織，喉鱗狀細胞癌組織中miR-33b、miR-3195相對表達量更低，且臨床TNM分期越晚合并淋巴結轉移患者組織中miR-33b、miR-3195表達量越低，表明miR-33b、miR-3195下調表達與腫瘤發生發展、侵襲與轉移具有密切關聯。患者組織中miR-33b、miR-3195表達量降低，且晚期與有淋巴結轉移者表達量低于早期和無淋巴結轉移患者，提示miR-33b、miR-3195表達下降，兩者可參與喉鱗狀細胞癌發生發展，可能是該腫瘤發生的重要機制，有待成為靶向治療新方向[15-16]。采用Spearman相關性分析法處理患者miR-33b、miR-3195表達量與臨床病理特征，結果顯示兩者與其呈負相關，miR-33b、miR-3195表達下調共同促進喉鱗狀細胞癌發生發展[17]。

綜上所述，miR-33b、miR-3195在喉鱗狀細胞癌組織中呈低表達狀態，且與患者臨床TNM分期、淋巴結轉移呈負相關，可作為評估患者病情嚴重程度與預后的標志物。