磷酸肌酸對糖尿病大鼠冠狀動脈的保護研究

蔚俊星 黨旭云

1 陜西省西安市第四醫院麻醉科 710004； 2 西安醫學院第一附屬醫院麻醉科

隨著人們生活水平的提高，糖尿病人群逐年增多，臨床上接受麻醉和手術的糖尿病患者也日益增加。糖尿病以損害全身血管為特點，可以累積心、腦、腎、眼及神經的病變。冠狀動脈疾病作為危害人類健康的常見病，冠脈再灌療法雖能在一定程度上減少壞死面積，改善心功能，但可引起再灌注損傷或殘留術后缺血區心肌灌注不足。因此，對于糖尿病患者冠狀動脈保護的研究對于改善患者預后具有深遠意義。

1 材料與方法

1.1 糖尿病模型的建立 40只雄性SD大鼠，由西安交通大學醫學院實驗動物中心提供，動物許可證號SCXK(陜)2017-001。體重250～300g。高脂飼養4周后，按40mg/kg腹腔注射鏈脲佐菌素，72h后采尾血測血糖，非空腹血糖≥16.7mmol/L持續1周者確定為糖尿病。飼養8周建立本研究所用糖尿病病程8周大鼠模型。建模過程中3只大鼠死于糖尿病，2只未達到血糖標準，故成模大鼠共35只。之后，研究中2只大鼠因未完成再灌注就已死亡，1只大鼠因冠脈血管環制備失敗，均剔除并補齊。

1.2 動物分組 所有成模糖尿病大鼠隨機分為4組(n=8)：假手術組(Ⅰ)，開胸后只穿線不結扎LAD。MIRI+生理鹽水組(Ⅱ)，結扎LAD前30min按20ml/kg腹腔注射生理鹽水。MIRI+PCr單次注射組(Ⅲ)，結扎LAD前30min按2g/kg腹腔注射PCr。MIRI+PCr多次注射組(Ⅳ)，按2g/kg腹腔注射PCr，實驗前5d開始，1次/d，共5次。

1.3 心肌缺血再灌注模型的建立 烏拉坦腹腔注射，麻醉后仰臥位固定于操作臺，氣管插管連接呼吸機，潮氣量6ml/100g，呼吸頻率60～80次/min。胸骨左側第3、4肋間開胸器暴露心臟，在左心耳和肺動脈圓錐間找到與左前降支(LAD)伴行的靜脈，放置塑料管，一并進行緊密結扎。成功扎閉LAD的標準：左室前壁發紺，向外膨出，且心電圖ST段抬高，T波高聳。于結扎成功30min后，拔出塑料管，再灌注2h。

1.4 冠脈血管環的制備 實驗結束，迅速分離出LAD，浸入冷的Krebs液中，顯微鏡下剝除外周脂肪及血管周圍的結締組織，制備成2～3mm的血管環。置于盛有37℃ Kerbs液的浴槽中，通有95%O2+5%CO2混合氣體，調節血管環的基礎張力為2mN，平衡60min，每15min更換1次Krebs液，正式實驗前需調零。以K+-Krebs液(含60mmol/L)檢驗動脈環收縮性，如果前后2次最大收縮幅度差<10%者，認為血管反應可重復，可開始正式實驗，借助張力傳感器，生理記錄儀觀察血管張力的變化。Kerbs液組成(NaCl 119mmol/L、NaHCO315mmol/L、KCl 4.6mmol/L、MgCl21.2mmol/L、NaH2PO41.2mmol/L、CaCl21.5mmol/L和葡萄糖5.6mmol/L)。K+-Krebs液組成(NaCl 60mmol/L、NaHCO315mmol/L、KCl 63.5mmol/L、MgCl21.2mmol/L、NaH2PO41.2mmol/L、CaCl21.5mmol/L和葡萄糖5.5mmol/L)。

1.5 指標測定

1.5.1 冠脈血管反應性的測定。舒張反應：平衡后，向浴槽內加入60mmol/L的KCl，待血管反應達到最大收縮峰值后，用濃度累加法加入Ach觀察血管的舒張反應，依次遞增使浴槽內終濃度為10-10、3×10-10、10-9、3×10-9、10-8、3×10-8、10-7、3×10-7、10-6、3×10-6、10-5、3×10-5，建立其濃度—效應曲線。再用Krebs液洗脫至基線，平衡40min后開始下一輪實驗。舒張反應的變化用舒張率表示=不同濃度Ach引起的松弛數/預先使用KCl引起的血管收縮數值×100%。

收縮反應：待血管穩定后，向浴槽內加入60mmol/L的KCl，3min后用Kerbs液洗脫，再用濃度累加法加入5-HT收縮血管，依次遞增使浴槽內終濃度為10-10、3×10-10、10-9、3×10-9、10-8、3×10-8、10-7、3×10-7、10-6、3×10-6、10-5、3×10-5，建立其累加濃度—效應曲線。收縮反應的變化用收縮率表示=不同濃度5-HT引起的張力/預先使用KCl引起的血管收縮數值×100%。

1.5.2 電鏡結果。實驗結束后，立即將LAD置于濃度為2.5%的戊二醛溶液中，4℃固定2h。用1%的四氧化鋨固定后用乙醇梯度脫水，環氧樹脂Epon812包埋，LKB-Ⅴ型超薄切片機進行超薄切片，鉛鈾雙重染色，H-600透射式電子顯微鏡下觀察拍照。

1.6 統計學方法 應用SPSS19.0統計軟件處理所得數據，所有數據以均數±標準差表示，采用重復測量設計的方差分析及單因素方差分析，P<0.05為差異有統計學意義，P<0.01為差異有高度統計學意義。

2 結果

2.1 冠脈血管反應性的測定

2.1.1 冠脈對Ach的舒張反應：累加濃度法觀察各組冠脈血管對Ach的濃度舒張曲線，同一濃度下與Ⅰ組相比，Ⅱ組的舒張率明顯下降(P<0.05)，Ⅲ、Ⅳ組無統計學差異(P>0.05)，見圖1。

圖1 各組大鼠冠脈血管對Ach的舒張作用量效曲線

2.1.2 冠脈對5-HT的收縮反應：同一濃度下與Ⅰ組相比，Ⅱ、Ⅲ組收縮率明顯升高(P<0.01)，Ⅳ組的變化無統計學差異(P<0.05);與Ⅱ、Ⅲ組相比，Ⅳ組收縮率明顯下降(P<0.01)，見圖2。

圖2 各組大鼠冠脈血管對5-HT的收縮作用量效曲線

2.2 電鏡下冠脈結構的變化 Ⅰ組：內皮細胞凸向管腔，內彈力膜厚薄不均，細胞核不規則，核內染色質輕度凝集，見圖3。Ⅱ組：內皮細胞腫脹脫落，細胞膜不完整，內彈力膜部分斷裂，細胞核呈圓形，核內染色質凝集，見圖4。Ⅲ組：內皮細胞貼于內彈力膜，內彈力膜基本均勻，細胞核形狀不規則，核內染色質輕度凝集，見圖5。Ⅳ組：內皮細胞貼附于內彈力膜上，內彈力膜厚薄均勻，細胞核扁平，核內染色質分布基本均勻，見圖6。

圖3 電鏡下Ⅰ組冠脈的結構(×5 000) 圖4 電鏡下Ⅱ組冠脈的結構(×5 000)

圖5 電鏡下Ⅲ組冠脈的結構(×5 000) 圖6 電鏡下Ⅳ組冠脈的結構(×5 000)

3 討論

糖尿病血管并發癥的發生發展與血管內皮細胞功能改變密切相關。內皮細胞作為血管的保護屏障，在高糖高脂環境下導致的氧化應激可損害內皮細胞的功能。內皮細胞合成分泌的多種活性物質參與了體內的病理生理過程[1]。正常情況下，血管內皮合成和釋放一定量的NO和ET-1，調節血管張力和通透性及抗凝作用來維持營養物質和氧供應到相應組織。

生理情況下，Ach通過激動內皮細胞M3膽堿受體亞型，導致內皮源性NO釋放而產生血管舒張。但在內皮細胞受損條件下，Ach的以上作用將不復存在。糖尿病內皮依賴性舒張功能異常，其機制還不清楚，它除了影響NO這條途徑，還可能與血管平滑肌受損有關。可能機制為：(1)糖尿病時NO合成減少活性降低；(2)NO滅活增加[2]，主要影響因素如氧自由基及糖基化終末產物；(3)降低對NO的反應性，通過影響鳥苷酸環化酶途徑；(4)對抗NO舒張效應的血管收縮劑如前列腺素類及內皮素的產生增加[3]。

病理情況下，內皮依賴性NO介導的舒張功能受損是糖尿病患者內皮功能障礙的指征[4]。如研究結果所示，糖尿病大鼠進行MIRI導致內皮細胞受損，以至于Ach內皮依賴性舒張功能明顯下降，即便PCr預處理對于冠脈內皮依賴性舒張功能并無明顯改善作用。而MIRI使冠脈對5-HT敏感性增高，最大收縮效能增強，PCr多次給藥預處理能夠降低冠脈對5-HT的高敏感性及收縮強度，在一定程度上可緩解冠脈血管的痙攣?？傊?，舒縮效應的總和是能增加冠脈血流量，增加心肌細胞灌注，從而起到心肌保護作用。前期研究也證實：磷酸肌酸能夠增加糖尿病大鼠MIRI后血漿中NO的含量，減少ET-1的含量，調節血管舒縮因子的平衡[5]。

線粒體功能障礙是糖尿病導致的內皮細胞功能損傷的早期事件[6]。線粒體的主要功能是為細胞供能，還與細胞代謝、凋亡及信號傳導通路相關[7]。糖尿病機體活性氧過度生成，可造成線粒體形態和功能的損害。如研究結果所示，缺血再灌注組內皮細胞明顯腫脹脫落，細胞膜不完整，線粒體明顯腫脹，部分呈空泡樣改變。PCr預處理組內皮細胞均無明顯水腫并貼附于內彈力膜，線粒體也無明顯腫脹。外源性PCr補給，可提高心肌及冠脈高能磷酸化合物的含量，減輕能量代謝障礙，使細胞膜上泵的活性得以維持，減輕細胞水腫及線粒體腫脹甚至凋亡，對于維持線粒體形態和功能起到保護作用。

綜上所述，PCr作為細胞重要的能量供應源，可為ATP補充能量，實驗表明PCr是心肌細胞在缺血條件下首先衰竭的物質，且在組織缺氧誘導下心肌細胞會反應性地增加外源PCr攝取[8]。目前臨床上已將它廣泛應用于治療心力衰竭、心肌梗死及體外循環手術，研究已證實，磷酸肌酸能夠改善糖尿病大鼠心肌缺血再灌注損傷后的心功能[9]，但對于冠脈保護的研究尚未報道。磷酸肌酸預處理，通過靶向改善線粒體功能，調節線粒體動力學平衡，抑制線粒體介導的凋亡是治療血管病變的重要途徑。對于線粒體功能的維護也就是對內皮細胞最大的保護，從而有益于冠脈血管舒縮功能的維持。