一種玉米種子細菌性病原菌的鑒定及其防治藥劑篩選

吳之濤，常 浩，李文學，楊克澤，馬金慧，徐志鵬，汪亮芳，任寶倉

(1.甘肅省農業工程技術研究院，甘肅武威 733006；2.甘肅省特種藥源植物種質創新與安全利用重點實驗室，甘肅武威 733006；3.甘肅省玉米病蟲害綠色防控工程研究中心，甘肅武威 733006；4.武威市玉米病蟲害綠色防控技術創新中心，甘肅武威 733006)

玉米(ZeamaysL.)屬禾本科玉蜀黍屬一年生草本植物，原產于墨西哥和中南美洲其他國家，因其具有良好的適應性在熱帶和溫帶地區廣泛種植，是全球重要的糧食作物之一。在中國，玉米不僅是重要的糧飼兼用型作物，同時也是重要的化工原料，種植面積和總產量居四大主糧作物之首，在現代農業產業結構中具有極其重要的地位。因此，玉米的安全生產對于保障國家糧食安全、食品安全、能源安全等都具有重要意義[1-2]。近年來，隨著農業種植產業結構的調整，玉米種植區域范圍不斷擴大、品種更替加快、氣候變化異常及耕作栽培模式轉變使玉米生產中面臨的病蟲害脅迫問題日益凸顯，嚴重影響玉米產業的健康高質量發展[3]。迄今為止全世界報道的玉米侵染性病害有185種，其中細菌性病原侵染的病害僅有20種[4]，在國內報道的玉米細菌病害主要有Acidovoraxavenaesubsp.avenae引起的細菌性條斑病[5]、Bacillusmegaterium引起的細菌性葉斑病[6]、Pseudomonassyringaepv.syringaeVan Hall引起的細菌性褐斑病[7]、Pseudomonasaeruginosa引起的細菌性莖腐病[8]、Pantoaeagglomerans引起的細菌性干莖腐病[9]等。目前關于玉米細菌性病害的研究報道相對較少，細菌性病害具有發病迅速、傳播速度快等特點，往往給農業生產造成嚴重損失。甘肅省張掖市是全國最大的雜交玉米種子生產基地，制種面積常年維持在6.7萬hm2左右，種子產業已逐漸成為當地助力脫貧攻堅，帶動農民增收的重要支柱產業[10]。2020年6月，在部分制種田發現整株玉米矮化皺縮，葉片卷曲，沿葉脈兩側出現不規則油漬狀褪綠條斑，發病部位葉片組織發白變薄，發病較重的生長點組織壞死，部分莖髓組織缺失，形成不規則缺刻，心葉缺失或呈筒狀，植株生長點部位彎曲，部分病株出現分蘗。經初步調查田間平均發病率在50%左右，嚴重時甚至絕產。為明確該病害的病原，本試驗收集發病植株玉米種子，對種子胚芽組織和種植的幼苗心葉生長點組織進行病原菌分離，結合致病性測定、病原菌形態特征、培養性狀、生理生化特征及16S～23S rDNA間隔區序列比對分析對分離的病原菌進行鑒定，并采用抑菌圈法對5種殺菌劑進行室內毒力測定，篩選出抑菌效果較好的藥劑，以期為該病害的防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試材料：玉米種子，品種為‘N70’。

NA培養基：牛肉浸膏3 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、瓊脂18 g、蒸餾水定容至1 000 mL，pH 7.0～7.2；KB培養基：胰蛋白胨20 g、K2HPO41.5 g、MgSO4·7H2O 1.5 g、甘油15 mL、瓊脂15 g、蒸餾水定容至1 000 mL；LB液體培養基：蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、NaCl 10 g、蒸餾水定容至 1 000 mL，pH 7.0～7.2。

結晶紫染劑，溶液Ⅰ：結晶紫2.0 g，乙醇(95%)20 mL；溶液Ⅱ：草酸銨0.8 g，蒸餾水80 mL。碘液：碘1.0 g、碘化鉀2.0 g，蒸餾水300 mL。復染劑：2.5%番紅乙醇溶液20 mL，蒸餾水80 mL。氧化酶試劑：1%鹽酸四甲基對苯撐二胺。接觸酶試劑：3%～10%過氧化氫。1%溴百里酚藍水溶液：先用少量95%乙醇溶解，再加蒸餾水配成1%的水溶液。格里斯試劑，溶液Ⅰ：對氨基苯磺酸0.5 g，稀醋酸(10%左右)150 mL；溶液Ⅱ：α-萘胺0.1 g、蒸餾水20 mL，稀醋酸(10%左右)150 mL。碳素化合物：D-半乳糖、海藻糖、D-甘露糖、D-果糖、蔗糖、L-阿拉伯糖、麥芽糖、D-纖維二糖；1%鹽酸四甲基對苯撐二胺、溴百里酚藍、對氨基苯磺酸、α-萘胺、D-半乳糖、海藻糖、D-甘露糖、D-纖維二糖、L-阿拉伯糖購于Takara公司。其他試劑購于天津市凱通化學試劑有限公司。

分子生物學試驗試劑及儀器：Mix(含MgCl2)，DNA Marker購于生工生物工程(上海)股份有限公司；T100 PCR儀及凝膠成像系統，美國Bio-Rad公司；721分光光度計，日本島津儀器公司；Ni-U顯微鏡，日本Nikon公司。

供試殺菌劑：10%中生·寡糖素可濕性粉劑，江蘇明德立達作物科技有限公司；47%春雷·王銅可濕性粉劑，江門市植保有限公司；3%噻霉酮可濕性粉劑，陜西西大華特科技實業有限公司； 0.3%四霉素水劑，遼寧微科生物工程股份有限公司；2%春雷霉素水劑，江門市植保有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 病原細菌的分離純化 將玉米種子(品種為‘N70’)先用體積分數75%的乙醇溶液表面消毒處理5 min，再用3% NaClO水溶液表面消毒處理5 min，最后用無菌水沖洗3次，然后加入適量 0.01 mol/L磷酸緩沖液(PBS，pH為7.2)在 4 ℃無菌條件下浸泡12 h。用無菌手術刀切取大小為3 mm×3 mm的胚芽組織塊置于加有300 μL滅菌水的白瓷板中充分研磨，用滅菌環蘸取研磨液在NA平板上劃線分離，置于光照培養箱中在28 ℃下培養48 h，挑取形態大小一致的單菌落進行純化，將純化的菌株在NA和KB培養基上培養72 h后，觀察菌落形態大小、顏色、表面光滑度。

玉米種子(品種為‘N70’)經3%NaClO水溶液表面消毒處理10 min后，用無菌水沖洗3遍，播種于裝有滅菌營養土的花盆中(d=30 cm)，待玉米長出4～5片真葉后，采集矮化皺縮植株的心葉生長點組織進行病原分離。幼苗心葉生長點組織用體積分數75%的乙醇溶液表面消毒處理 1 min，無菌水沖洗3次，用滅菌手術刀切取大小為5 mm×5 mm的組織塊置于加有300 μL滅菌水的白瓷板中充分研磨，用滅菌環蘸取研磨液在NA平板上劃線分離，置于光照培養箱中在28 ℃下培養48 h，挑取形態大小一致的單菌落進行純化，將純化的菌株在NA和KB培養基上培養 72 h后，觀察菌落形態大小、顏色、表面光滑度。

1.2.2 致病性測定 將“1.2.1”中純化的菌株挑取單菌落接種于裝有LB液體培養基的三角瓶中，在28 ℃、200 r/min條件下搖培24 h，制成菌液懸浮液。用分光光度計測定菌液懸浮液OD600nm的吸光度值，當數值達到0.3時，細菌懸浮液的濃度為3×108CFU/mL，備用。

玉米種子(品種為‘N70’)經3%NaClO水溶液表面消毒處理10 min后，用無菌水沖洗3遍，將種子置于恒溫干燥箱內(溫度為65 ℃)干熱消毒1 h，播種于裝有滅菌營養土的花盆中(d=30 cm)，每盆播種20粒，置于相對濕度65%～75%、溫度15～25 ℃、自然光照的日光溫室中進行培養。當玉米長到4～5片真葉時進行間苗，剔除弱苗，每盆保留10株長勢一致的植株進行致病性測定。采用噴霧法接種，用無菌噴壺將濃度為3×108CFU/mL的細菌懸浮液均勻噴灑在玉米葉片上，每盆噴10 mL，以噴等量無菌水作為對照，每個菌株接種30株，接種后套袋保濕培養，3 d后觀察植株發病情況。

1.2.3 病原細菌生理生化特征測定 參照常見細菌系統鑒定方法[11-12]對分離純化的病原細菌菌株分別進行革蘭氏染色試驗、熒光產生試驗、煙草過敏反應試驗、氧化酶試驗、接觸酶試驗、41 ℃下生長試驗、耐鹽性試驗、馬鈴薯腐敗試驗、淀粉水解試驗、明膠液化試驗、硝酸鹽還原試驗、H2S產生試驗及對D-半乳糖、海藻糖、D-甘露糖、D-果糖、蔗糖、L-阿拉伯糖、麥芽糖、D-纖維二糖等碳源的利用試驗，每個菌株3次重復。

1.2.4 病原細菌分子生物學鑒定 選取從玉米種子胚芽組織和幼苗心葉生長點組織分離純化的細菌菌株進行分子生物學鑒定。采用CTAB法[13]提取細菌菌株基因組DNA，利用植物病原細菌16S～23S rDNA間隔區序列的通用引物L1：5′-AGTCGTAACAACGTAGCCGT-3′和L2：5′-GTGCCAAGGCATCC-ACC-3′對細菌菌株基因組DNA進行PCR擴增。PCR反應體系(25 μL)為：引物L1和L2各1 μL，細菌菌株基因組DNA 1 μL，Mix(含MgCl2)12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR擴增條件為：95 ℃預變性300 s； 94 ℃變性30 s，60 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s，35個循環；72 ℃延伸600 s。PCR擴增產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，之后送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。登錄NCBI網站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)將測序結果與GenBank中相關核苷酸序列進行BLAST比對，利用MEGA5.0軟件(最大似然法Maximum Lik-elihood)構建系統發育樹，確定細菌菌株的 種屬。

1.2.5 病原細菌室內毒力測定 選擇5種殺菌劑對從玉米種子胚芽組織分離純化的菌株進行室內毒力測定。采用抑菌圈法[14]，參照“1.2.2”的方法配置濃度為1×108CFU/mL的菌液懸浮液，待NA培養基冷卻至40 ℃與菌懸液混合均勻(體積比為10∶1)后制成含菌平板。在每個含菌NA平板上分別放置3片單層無菌濾紙片(d=5 mm)，以等邊三角形的方式排列。根據供試藥劑的推薦劑量每種藥劑配置成5個不同濃度，其中10%中生·寡糖素可濕性粉劑濃度分別為250、500、1 000、2 000和3 000 μg/mL，3%噻霉酮可濕性粉劑濃度分別為1 000、2 000、3 000、4 000和5 000 μg/mL，2%春雷霉素水劑濃度分別為 2 000、4 000、6 000、8 000和10 000 μg/mL，47%春雷·王銅可濕性粉劑和0.3%四霉素水劑濃度分別500、1 000、2 000、3 000和4 000 μg/mL。在含菌NA平板濾紙片上分別滴加10 μL不同濃度藥液，以滴加等量無菌水為空白對照，之后將培養皿置于光照培養箱中在28 ℃培養48 h，采用十字交叉法測量各藥劑濃度處理的抑菌圈直徑，計算抑菌率。抑菌率=(處理抑菌圈直徑-對照抑菌圈直徑)/(處理抑菌圈直徑-紙碟直徑)×100%。

采用SPSS19.0統計分析軟件進行毒力回歸方程數據分析，藥劑濃度換算成對數值作為自變量x，抑菌率的幾率值作為因變量y，建立毒力回歸方程，通過毒力回歸方程計算各藥劑抑制中濃度(EC50)值。

2 結果與分析

2.1 病害田間癥狀

2020 年6月在調查玉米制種田病害時發現玉米植株生長點壞死，無心葉病株(圖1)，同時發現部分玉米病株整株矮化，葉片卷曲，沿葉脈兩側出現不規則油漬狀褪綠條斑，發病部位葉片組織發白變薄；剝開葉鞘后，在心葉生長點部位零星出現黃褐色病斑，發病較重時生長點壞死，部分莖髓組織缺失，形成不規則缺刻，心葉缺失或呈筒狀，植株生長點部位彎曲，部分病株出現分蘗。

A.植株矮化；B、C.心葉缺失、壞死；D.異常分蘗A.Plant dwarfing；B,C.Absence and necrosis of plant heart leaves；D.Abnormal tillering圖1 病害田間癥狀Fig.1 Symptoms of maize bacterial disease in field

2.2 病原細菌形態特征

采用平板劃線分離法對玉米種子胚芽組織、幼苗心葉生長點組織進行分離和純化得到培養性狀一致的2株菌株，分別命名為YM-001和YM-002。在NA培養基上生長48 h后，2株菌株菌落顏色呈淡黃色，圓形，稍凸起，表面光滑，邊緣整齊，在培養基上不產生其他色素，菌落呈半透明，質地較軟微粘。在100倍油鏡下觀察發現YM-001和YM-002菌體形態呈短桿狀，單生或對生，大小分別為0.28～0.85 μm×1.11～1.81 μm和 0.21～0.78 μm×1.13～1.83 μm；在紫外燈下觀察KB培養基上生長的菌株，YM-001和YM-002均產生黃綠色熒光(圖2)。

A、B.菌株YM-001、YM-002菌落形態；C、D.菌株YM-001、YM-002革蘭氏染色形態；E、F.菌株YM-001、YM-002熒光觀察A,B.Colony morphology of strains YM-001 and YM-002；C,D.Gram staining morphology of strains YM-001 and YM-002；E,F.Fluorescence observation of strains YM-001 and YM-002圖2 病原細菌菌落形態特征Fig.2 Colony morphology of pathogenic bacteria

2.3 分離菌株的致病性測定

帶菌種子播種后，苗期發病癥狀主要表現為植株矮化、葉片皺縮且邊緣出現缺刻，葉片表面出現褪綠透明白色斑點，斑點背面呈水漬狀，心葉卷曲(圖3-A)；成株期葉鞘部位沿葉脈兩側出現不規則油漬狀褪綠黃褐色條斑，剝開葉鞘后，在心葉生長點部位零星出現黃褐色病斑，心葉壞死卷曲，植株沿生長點缺失部位彎曲(圖3-B)。菌株YM-001和YM-002的菌懸液噴霧接種后第3天，接種植株的部分葉片零星出現不規則油漬狀褪綠病斑，接種后第7天，油漬狀褪綠病斑沿葉脈擴展產生白色條狀病斑，發病部位葉片組織變薄卷曲枯死，邊緣出現缺刻，部分植株生長點組織壞死，心葉皺縮缺失，異常矮化(圖3-C、3-D和3-E)。接種植株發病癥狀與田間癥狀基本一致，對照植株生長正常未見明顯異常。對發病植株的心葉生長點組織進行再次分離，重新進行形態學和分子生物學鑒定，結果表明分離菌株與接種菌株病原一致。

A.苗期癥狀；B.成株期癥狀；C.接種菌株YM-001；D.接種菌株YM-002；E.接種菌株YM-001和YM-002發病癥狀；F.清水對照A.Seedling symptoms；B.Adult symptoms；C.Inoculation strain YM-001；D.Inoculation strain YM-002；E.Symptoms of inoculated strains YM-001 and YM-002；F.Control圖3 病原細菌致病性測定Fig.3 Pathogenicity determination of pathogenic bacteria

2.4 病原細菌生理生化特征

病原細菌生理生化特征測定結果表明，供試菌株YM-001和YM-002均為革蘭氏陽性、兼性厭氧型細菌；煙草過敏反應試驗、氧化酶試驗、過氧化氫酶試驗及硝酸鹽還原試驗結果均呈陽性；馬鈴薯腐敗試驗、淀粉水解試驗及明膠液化試驗結果均呈陰性，不能利用胱氨酸產生H2S；在 41 ℃不能培養生長，在20～40 g/L NaCl溶液中可以生長；能利用半乳糖、海藻糖、D-甘露糖、D-果糖、蔗糖、L-阿拉伯糖及麥芽糖作為碳源產酸，不能利用D-纖維二糖產酸(表1)。

表1 供試菌株生理生化特征Table 1 Physiological and biochemical characteristics of tested strains

2.5 病原細菌分子生物學鑒定

采用16S～23S rDNA間隔區序列通用引物L1/L2對供試菌株YM-001和YM-002的基因組DNA進行PCR擴增，測序獲得核苷酸序列(約900 bp)，將其與GenBank中提交的核苷酸序列進行同源性比對，結果顯示病原細菌與水稻、棉花、香蕉等寄主植物上分離的分散泛菌(Pantoeadispersa)的同源性達到100%。采用 MEGA5.0軟件的Maximum Likelihood法對泛菌屬3個不同種(P.agglomerans、P.ananatis、P.dispersa)、黃單胞菌屬(Xanthomonasoryzae)、芽孢桿菌屬(Bacillussubtilis)與供試菌株YM-001、YM-002構建系統發育樹，結果表明YM-001和YM-002與登錄號為MK156738、MT367860、MK905711、MG450362的P.dispersa聚在一個分支上，置信度達到100(圖4)，同時結合菌落形態特性和生理生化特征，將菌株YM-001和YM-002鑒定為Pantoeadispersa。

圖4 基于16S～23S rDNA間隔區序列構建的系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree based on 16S-23S rDNA sequence

2.6 病原細菌室內毒力測定

采用抑菌圈法進行室內毒力測定，結果顯示(表2)5種殺菌劑對菌株YM-001均有一定的抑菌效果，其中0.3%四霉素水劑和47%春雷·王銅可濕性粉劑的抑菌率分別為75.52%和 70.53%。0.3%四霉素水劑EC50值最小為 670.84 μg/mL，47%春雷·王銅可濕性粉劑次之，為920.99 μg/mL。

表2 不同藥劑對玉米細菌菌株的毒力Table 2 Toxicity test of different bactericides on maize bacterial strains

3 討論與結論

本試驗通過病原細菌菌落形態特征、生理生化特征及16S-23S rDNA間隔區序列基因組測定和比對分析，將供試玉米種子細菌性病原初步鑒定為分散泛菌(P.dispersa)，雖然與前人報道的玉米細菌性褐腐病病原一致，但病害的危害時期、田間表現癥狀都存在很大差異。該病害主要在玉米拔節前期危害心葉生長點組織，造成植株皺縮矮化、心葉缺失、異常分蘗，顧沁等[15]報道的玉米細菌性褐腐病主要在灌漿期發生，使植株莖稈表面出現黃褐色干腐、葉梢枯死。相關研究表明，泛菌屬細菌是一種腐生菌或植物病斑上的次生菌，在水中、土壤中和動植物傷口中都能分離到[16]，目前關于泛菌屬細菌在玉米上引起的病害也有報道。王玲等[17]研究表明玉米細菌性枯萎病的病原為斯氏泛菌(P.stewartii)，由于其侵染危害性較強，已被我國列為檢疫性病害對象，曹慧英[9]研究發現成團泛菌(P.agglomerans)可引起玉米細菌性干莖腐病。國外學者研究發現引起玉米葉疫病和細菌性枯萎病的病原為成團泛菌(P.agglomerans)[18]，引起玉米細菌性褐腐病的病原為菠蘿泛菌(P.ananatis)[19]，其中斯氏泛菌(P.stewartii)和菠蘿泛菌(P.ananatis)復合侵染高粱也會引起葉斑病[20]。近年來，在國內外由泛菌屬細菌引起的植物病害發生面積和危害程度逐漸擴大，越來越受到人們的關注，目前由分散泛菌(P.dispersa)引起的水稻葉枯病、棉花鈴腐病、香蕉腐爛病已有報道，但在玉米上引起的病害則鮮有報道。本試驗對玉米種子(品種為‘N70’)種植后進行帶菌檢測，發現幼苗發病率達15.28%，同時對種子胚芽組織和幼苗心葉生長點組織進行病原分離與純化，獲得菌落形態特性一致的2株菌株進行致病性測定，結果顯示植株在溫室中的發病癥狀與田間癥狀基本一致，經鑒定分離的病原菌與接種的病原菌相同。初步明確病原從種子內部開始侵染，種子帶菌可能是該病害初侵染的主要來源。由于制種玉米田連作年限較長導致土壤菌群結構發生變化，致病菌增多，土壤中是否存在分散泛菌(P.dispersa)侵染玉米種子而引起病害癥狀還有待進一步研究。同時，本試驗僅對玉米種子細菌性病原進行了鑒定，而由該菌引起的整個病害侵染過程還需要設計系統試驗進一步驗證。

目前，生產上用于細菌病害防治的藥劑較少，主要選用抗生素類藥劑或銅制劑對病害進行防治。本試驗選用5種殺菌劑對病原細菌進行室內毒力測定，試驗結果表明抗生素類藥劑的抑菌效果優于非抗生素類藥劑且用量較少，其中0.3%四霉素水劑抑菌率最高為75.52%，抑制中濃度EC50最低為670.84 μg/mL，其次為47%春雷·王銅可濕性粉劑，這與前人在番茄細菌性葉斑病[21]、糜子細菌性條斑病[22]上報道的研究結果相一致。考慮到該病害可能是由種子帶菌引起的，在生產上可以采取種子包衣的措施對病害進行有效防治。0.3%四霉素水劑和47%春雷·王銅可濕性粉劑殺菌譜廣、持效期較長、具有內吸傳導特性，對作物安全、促進作物生長，同時對該病原具有較好的抑菌效果，可以作為該病的田間防治藥劑，但田間防效還有待進一步試驗驗證。