青花菜高溫和鹽脅迫相關LncRNAs的鑒定與表達特征分析

裴徐梨，荊贊革，唐 征，羅天寬

(1.昆明學院 農學與生命科學學院，昆明 650214；2.溫州科技職業學院 農業與生物技術學院，浙江溫州 325006)

長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA，LncRNA)是一類長度大于200 nt且沒有長開放閱讀框的RNA[1]。LncRNAs在真核生物中普遍存在，其含有較少的內含子及較低的表達水平。LncRNAs根據其與相鄰基因的相對位置可分為基因間LncRNAs、基因內LncRNAs及與編碼序列反義LncRNAs。研究發現LncRNAs能在轉錄水平、轉錄后水平和表觀遺傳等層面調控生命進程[2-4]。目前，植物LncRNAs的研究相對較少，研究材料多集中在擬南芥、玉米、水稻、番茄等模式植物中。Enod40是第一個在植物中發現的LncRNA，其在蒺藜苜蓿體內發揮著重要生物功能[5]。前人通過ESTs、RNA-Seq等技術在擬南芥中鑒定得到13 000多條LncRNAs[6]，研究發現這些LncRNAs參與了擬南芥的開花、逆境脅迫等多種生命進程。過表達LncRNA T5120可促進擬南芥對硝酸鹽的同化，提高其生物量和根系的發育[7]。TaS1和TaS2的大量表達可以提高小麥對白粉病的抗性[8]。此外，過表達lncRNA LAIR可提高水稻產量及其鄰近基因簇的表達[9]。在玉米中鑒定到3 488條LncRNAs，其中1 535條可響應干旱脅迫[10]。

高溫和高鹽對于青花菜的生長極為不利。青花菜花球的最佳形成溫度為22 ℃，溫度過高使花球形成受阻從而降低產量[11]。高鹽脅迫使青花菜根系活力受到抑制，根系吸收能力下降，葉片光合作用受到嚴重影響[12]。因此，探討青花菜在高溫和鹽脅迫下的響應機制對于青花菜生產具有重要的現實意義。

LncRNAs是轉錄組的重要組成部分，在植物器官發育[13]、生物[14]和非生物脅迫[15]等過程中起著重要的調控作用。本研究成功構建青花菜高溫和鹽脅迫的LncRNAs文庫，并進行差異 LncRNAs的鑒定、靶基因注釋以及表達特征等分析，研究結果為進一步分析LncRNAs在青花菜高溫和鹽脅迫下的調控機制提供一定的基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以青花菜(Brassicaoleraceavar.italica)高代自交系‘WN12-95B’為試驗材料，種植于光照培養箱內(白天：16 h光照，25 ℃；夜晚：8 h黑暗處理，18 ℃；相對濕度：85%)，5葉期時進行高溫(38 ℃)和鹽(200 nm/L NaCl)脅迫處理，處理時間為3 h和12 h，以0 h為對照。脅迫處理設3次生物學重復。處理結束后，取第3片葉用于高通量測序和qRT-PCR分析。

1.2 青花菜總RNA提取及RNA文庫構建

提取葉片總RNA，經檢測合格后，進行文庫構建，于北京組學生物科技有限公司進行高通量測序。

1.3 高通量測序數據分析

測序所得的原始數據(raw data)經處理后，對產出數據進行分析和統計。利用TopHat2 軟件[16]將clean reads與甘藍基因組進行序列比對，獲取序列特征信息。

1.4 青花菜LncRNAs鑒定

使用Cufflinks和Scripture軟件對轉錄本進行拼接[17]。根據LncRNAs的結構以及非編碼功能特點，篩選候選lincRNA、intronic LncRNA、anti-sense LncRNA類型的轉錄本。具體篩選步驟參照Zhang等[18]的進行。

1.5 青花菜LncRNAs差異表達分析

采用FPKM法計算LncRNAs的表達水平。差異表達LncRNAs的檢測標準為：|Fold Change|≥ 2且FDR<0.01。對篩選出的差異表達LncRNAs使用Cluster 3.0軟件進行層次聚類分析[19]。

1.6 青花菜LncRNAs靶基因預測

采用LncTar軟件對鑒定得到的LncRNAs進行cis靶基因預測[20]。trans作用靶基因根據Pearson相關系數法進行預測。

1.7 青花菜差異表達LncRNAs靶基因功能注釋和富集分析

對cis、trans作用模式下的差異表達LncRNAs靶基因進行GO和KEGG注釋，并進行富集分析。

1.8 青花菜差異LncRNAs表達特征分析

從表達量變化較大的LncRNAs中隨機挑選10個LncRNAs進行qRT-PCR驗證(表1)，以actin為內參(F:GACAACTTACAACTCCATCAT；R:CTCATACGGTCAGCGATA)。反應過程依據SYBR Premix Ex Taq試劑盒(TaKaRa公司)說明書在ABI 7500(Applied Biosystems公司)上進行。反應總體系及反應程序參照Xu等[21]進行。每個反應設3次技術重復。定量數據處理采用2-ΔΔCT法[22]。

表1 LncRNAs的qRT-PCR特異性引物Table 1 LncRNAs-specific primers for qRT-PCR

2 結果與分析

2.1 測序結果的初步分析

在高溫和鹽脅迫文庫中分別獲得38 738 918(CK)、35 895 588(HEAT-3H)、38 622 915(HEAT-12H)、35 772 779 (SALT-3H)和35 764 013(SALT-12H)條clean pair-end reads。文庫的平均GC含量為42.53%，Q30比例均大于91%(表2)。將clean reads比對到甘藍基因組，結果分別得到47 111 785(CK)、45 815 806(HEAT-3H)、52 658 043(HEAT-12H)、49 140 771(SALT-3H)和49 700 942(SALT-12H)條單一比對序列，文庫平均比對率約為75%。

表2 青花菜轉錄組測序結果及數據質量匯總Table 2 Summary of transcriptome sequencing result and data quality in broccoli

2.2 青花菜LncRNAs鑒定結果分析

5個文庫中共鑒定得到2 432條LncRNAs，其中31條為intronic RNA，79條為anti-sense RNA，2 322條為lincRNA。結構分析顯示LncRNAs的長度較mRNA短，主要集中于200～ 2 600之間；外顯子個數多為2～13個不等，也比mRNA少。

2.3 青花菜差異LncRNAs的鑒定

通過比較不同處理間的LncRNAs表達量，鑒定出差異LncRNAs分別為41(CK vs HEAT-3H)、43(CK vs HEAT-12H)、12(HEAT-3H vs HEAT-12H)和17(CK vs SALT-3H)、24(CK vs SALT-12H)和21(SALT-3H vs SALT-12H)條。其中96條LncRNAs上調表達，62條LncRNAs下調表達。

對差異LncRNAs進行聚類分析發現，高溫脅迫下上調表達的LncRNAs數量較鹽脅迫多，且變化幅度更大，兩種脅迫處理后的差異LncRNAs表達模式差異較大(圖1)。XLOC_002584在高溫脅迫12 h的表達量為CK的18倍，但在鹽脅迫中的表達量差異較小；XLOC_003847在高溫脅迫過程中表達量變化趨勢平緩，但在鹽脅迫12 h表達量達到峰值，為CK的2倍；XLOC_005515在高溫和鹽脅迫處理后，表達量急劇 下降。

圖1 青花菜差異表達LncRNAs的層次聚類分析Fig.1 Hierarchical clustering analysis of differentially expressed LncRNAs in broccoli

2.4 LncRNAs靶基因預測

為了探討LncRNAs的調控網絡，對篩選得到的LncRNAs進行靶基因預測。分別獲得 8 891條cis作用靶基因和177 364條trans作用靶基因。部分靶基因羅列在表3。

表3 部分青花菜LncRNAs靶基因的代謝通路分析Table 3 Pathway analysis of partial target genes of LncRNAs in broccoli

對差異表達LncRNAs的cis作用靶基因進行分析，發現高溫處理組中CK vs HEAT-3H與HEAT-3H vs HEAT-12H在3個類別中的富集數目相差不大，而在CK vs HEAT-12H中沒有富集到生物過程條目；鹽脅迫處理組中較多靶基因映射到分子功能條目。KEGG富集分析發現“核糖體相關”是高溫處理中差異LncRNAs參與最多的pathway，而鹽脅迫中“氧化磷酸化”和“植物激素信號轉導”分別是CK vs SALT-3H和SALT-3H vs SALT-12H富集最多的途徑。

對差異表達LncRNAs的trans作用靶基因進行分析，發現在GO分析的 3大域中生物過程是富集最多的條目，包括“DNA甲基化(DNA methylation)”“水楊酸脅迫反應(response to salicylic acid)”“胚胎發育(embryo development)”“H3-K9組蛋白甲基化(histone H3-K9 methylation)”等。KEGG結果顯示富集量較多的靶基因參與了谷胱甘肽代謝、氨基酸合成、淀粉及糖代謝、半乳糖代謝以及脂肪酸延伸和代謝。

2.5 青花菜差異LncRNAs表達特征分析

使用qRT-PCR技術檢測了10個差異LncRNAs在高溫和鹽脅迫下的表達模式，結果發現其表達模式與測序結果基本一致。XLOC_033957和XLOC_034964在鹽脅迫的表達下調，在高溫脅迫的表達量先下降再上升。XLOC_005515、XLOC_027154、XLOC_023592和XLOC_035830的表達量在高溫脅迫下先下降再上升。但在鹽脅迫中表達模式存在差異，XLOC_005515和XLOC_027154先下降后上升，而XLOC_023592和XLOC_035830的表達量逐漸下降。此外，XLOC_033671、XLOC_003826、XLOC_06988和XLOC_024730也具有相同的表達模式，在鹽脅迫中持續上調表達，在高溫脅迫中先上升后下降，高溫脅迫3 h的表達量最高(圖2)。

Y3H和Y12H分別代表鹽脅迫3 h和鹽脅迫12 h；H3H和H12H分別代表高溫脅迫3 h和高溫脅迫12 hY3H and Y12H represent 3 h and 12 h under salt stress treatment, respectively；H3H and H12H represent 3 h and 12 h under heat stress treatment, respectively圖2 10個差異LncRNAs在青花菜高溫和鹽脅迫下的表達特征Fig.2 Expression characteristics of 10 differentially expressed LncRNAs under high temperature and salt stress in broccoli

3 討 論

本研究構建了青花菜高溫和鹽脅迫的LncRNAs文庫，獲得184.77 M clean reads，平均每個文庫36.95 M，此結果大于前人在青花菜種子及幼苗中測序得到的read數目[23]。更多的測序數量有利于表達量相對較低的LncRNAs的鑒定[24]。因此，本文的測序數據對于鑒定青花菜高溫和鹽脅迫LncRNAs具有較好的可靠度。篩選出的青花菜LncRNAs也符合LncRNAs的一般特征：長度、外顯子數以及表達量均比mRNA小。

在鹽脅迫條件下，氨基酸、蛋白質及其他激素類物質含量會發生變化，最終造成植物生理代謝紊亂[25]。氧化磷酸化相關的轉錄因子可調節脅迫響應基因的表達[26]，而氧化磷酸化過程是青花菜差異LncRNAs的靶基因在鹽脅迫中富集較多的途徑之一。青花菜XLOC_035830的靶基因為氧化磷酸化酶，該LncRNAs的表達量先下降后上升，其靶基因Bol018386(coproporphyrinogen oxidase)的表達量下調，推測XLOC_035830通過調控氧化磷酸化酶基因的表達進行鹽脅迫響應。乙烯和生長素是植物生長發育的重要激素，同時還是調控植物對非生物脅迫的重要因子[27]。本試驗中XLOC_003579及其靶向的生長素基因(Bol019000)在青花菜鹽脅迫過程中表達受到抑制，表明某些青花菜生長素相關基因的表達可受到鹽脅迫的調控。此外，XLOC_021367的靶基因Bol019606(ethylene-responsive transcription factor)可參與乙烯代謝途徑，其表達量在青花菜鹽脅迫過程中先上升后下降，表明XLOC_021367可通過靶基因調控乙烯介導的信號通路來對鹽脅迫進行響應。

高溫脅迫使植物質膜流動性增加，從而促使類受體蛋白激酶向細胞傳遞高溫信號，同時激活相關轉錄因子[28]。本研究發現差異LncRNAsXLOC_023592的靶基因為凝集素類受體蛋白激酶(Bol039139)，該激酶是類受體蛋白激酶家族中的一個亞族，在植物生物/非生物脅迫和發育調控中發揮非常重要的作用[29]。qRT-PCR分析發現XLOC_023592及其靶基因的表達量隨著高溫脅迫時間的延長逐漸下降，表明抑制該LncRNAs的表達，可能會導致其靶基因表達受限從而影響青花菜高溫脅迫的響應。熱激蛋白合成可以提高植物的耐熱性，異位表達擬南芥的谷氧還原蛋白可提高HSP基因的表達來增加耐熱性[12]。XLOC_003826靶向熱激蛋白基因(Bol005002)，高溫脅迫12 h的表達量為CK的8倍，靶基因的表達量也隨著高溫脅迫時間的延長而快速增加，由此推測該LncRNAs是高溫脅迫響應過程中的重要調控因子。此外，對青花菜在高溫脅迫下的差異LncRNAs進行注釋，發現高溫脅迫相關的差異LncRNAs參與了青花菜的谷胱甘肽代謝、信號轉導以及脂肪酸延伸和代謝等過程。谷胱甘肽轉移酶蛋白基因(Bol033291)是XLOC_025914的靶基因，該LncRNA和其靶基因的表達模式相反，推測該LncRNAs可通過負調控其靶基因的表達來參與青花菜的熱脅迫過程。

4 結 論

本研究鑒定到青花菜高溫和鹽脅迫相關LncRNAs 2 432條，其中31條為intronic RNA，79條為anti-sense RNA，2 322條為lincRNA。LncRNAs的表達水平整體較mRNA低，且長度和外顯子個數比mRNA少。篩選得到96條上調和62條下調的差異LncRNAs。通過GO和KEGG注釋發現這些差異LncRNAs可參與青花菜高溫和鹽脅迫中的植物激素信號轉導、谷胱甘肽代謝以及氧化磷酸化等過程。實時熒光定量分析表明10個差異LncRNAs在高溫和鹽脅迫下的表達模式存在差異。研究結果為進一步分析LncRNA在青花菜逆境脅迫中的調控機理提供理論基礎。