分子伴侶4-苯基丁酸通過抑制內質網應激減輕寄生疫霉菌對植物的侵染

魏玉樹，唐雅伶，王小雪，高賢賢，單衛(wèi)星，強曉玉

(西北農林科技大學 農學院,陜西楊凌 712100)

蛋白質是參與生命體代謝、信號轉導和生長發(fā)育的重要大分子，而蛋白質的合成和正確的折疊修飾對其發(fā)揮功能至關重要。內質網作為重要的細胞器，主要用于蛋白折疊和翻譯后修飾。真核生物中普遍存在一個負責監(jiān)測蛋白質折疊水平的系統(tǒng)，即內質網質量監(jiān)控系統(tǒng)(Endoplasmic reticulum quality control, ERQC)。通常，ERQC可通過定位于內質網的分子伴侶蛋白、寡聚糖轉移酶亞基等關鍵因子來維持蛋白折疊加工的穩(wěn)定秩序，以保證內質網功能的正常發(fā)揮。然而在外界環(huán)境脅迫壓力下，細胞會產生大量分泌蛋白進入內質網，使得ERQC難以維持平衡，非折疊蛋白在內質網的積累則引發(fā)內質網應激(ER stress)。而內質網應激效應(Unfolded Protein Response，UPR)作為真核細胞中保守的適應性機制，能夠通過位于內質網膜的感應因子識別內質網應激并激活不同的信號級聯通路，增強 ERQC 相關蛋白合成、減弱蛋白翻譯速率、加快內質網相關蛋白的分泌與降解，從而修復內質網的正常功能并維持細胞穩(wěn)定[1-3]。研究表明，健康的內質網功能和UPR在植物抵御病原菌入侵以及增強植物逆境適應性方面發(fā)揮著關鍵作用[4-11]。

寄生疫霉菌(Phytophthoraparasitica)是一類典型的土傳植物病原菌，該病原菌的侵染可引發(fā)煙草黑脛病、柑橘根腐病和流膠病等多種植物病害。寄生疫霉菌的侵染循環(huán)與致病疫霉菌和大豆疫霉菌相似，既能產生無性游動孢子也能產生厚壁的有性卵孢子。由于寄生疫霉菌的寄主范圍比較廣泛，且寄生疫霉菌遺傳轉化體系成熟，因此，寄生疫霉菌被作為一種重要模式卵菌。寄生疫霉菌具有典型的半活體營養(yǎng)生長特征，在其侵染寄主植物初期的活性營養(yǎng)生長階段，植物的免疫響應尤為活躍。Qiang等[12]及鄭晴[13]借助寄生疫霉菌與模式植物擬南芥親和互作的研究體系，揭示寄生疫霉菌在早期活體營養(yǎng)侵染階段可促使植物細胞的內質網超微結構發(fā)生異常，并伴隨著內質網應激信號的誘導激活，說明植物響應寄生疫霉菌早期侵染時，內質網的正常功能受到干擾，并且產生了內質網應激現象。然而，內質網應激的發(fā)生對寄生疫霉菌侵染寄主植物的影響機制尚不清楚。

4-苯基丁酸(4-phenylbutyric acid, 4-PBA)是一種具有分子伴侶作用的短鏈芳香族脂肪酸，它可以修復或逆轉蛋白質分子的錯誤移位和錯誤折疊，并幫助其建立正常的空間結構，從而達到緩解內質網應激的作用[14]。因此，4-PBA也通常被定義為內質網應激修復劑。目前，4-PBA在醫(yī)學和藥物研發(fā)等領域已有廣泛的報道與應用。例如，4-PBA通過抑制內質網應激，能夠減輕動物的神經元損失，從而為預防治療阿爾茨海默病等神經變性疾病提供了理論依據[15]。有研究表明，4-PBA可通過抑制PERK/Bip介導的內質網應激信號通路，進而緩解由內質網應激引起的骨關節(jié)炎(OA)大鼠的關節(jié)損傷[16]。然而，4-PBA在病原微生物引發(fā)寄主植物產生的內質網應激中的作用尚不明確，尤其是在植物抵御病原微生物侵染的過程中是否發(fā)揮功能鮮有報道。本研究中，筆者對寄生疫霉菌侵染的擬南芥植株進行4-PBA處理，發(fā)現低濃度4-PBA在不影響植物正常生長的同時，不僅能夠緩解由病菌侵染而誘導產生的植物內質網應激，而且可有效減輕寄生疫霉菌在植物體內的定殖生物量，從而緩解植物的感病表型。這為深入揭示內質網應激對植物與微生物互作的影響機制提供理論基礎，并為開發(fā)新型藥物靶點應用于作物疫霉屬卵菌病害的綠色綜合防控提供了新思路。

1 材料與方法

1.1 植物材料，病原菌接種及4-PBA處理

植物材料：擬南芥野生型Col-0種子，寄生疫霉菌(帶綠色熒光蛋白GFP的轉化菌株，1121)由西北農林科技大學單衛(wèi)星實驗室保存。

培養(yǎng)基：5%固體CA培養(yǎng)基(胡蘿卜汁25 mL、CaCO30.05 g、β-谷甾醇10 mg、瓊脂3.75 g， 加水定容至500 mL，121 ℃濕熱滅菌 30 min)。鹽溶液(5 mmol/L KNO3、0.02 mmol/L FeSO4、4 mmol/L MgSO4、10 mmol/L CaNO3、0.02 mmol/L EDTA-Na2)。

擬南芥皿內種植：用滅菌水清洗種子表面雜質，用75%乙醇處理種子1 min，立即用滅菌水清洗種子表面乙醇，再用1%次氯酸鈉處理10 min，用滅菌ddH2O沖洗種子4次，最后將種子置于滅菌濾紙上吹干，于4 ℃冰箱中黑暗放置3 d后，在超凈工作臺中用移液槍點于培養(yǎng)基上，在23 ℃植物培養(yǎng)箱(光照12 h，黑暗12 h)中培養(yǎng)，用于生長敏感性分析的幼苗于10 d后處理，用于接菌處理的幼苗于2周后處理。

基質種植的擬南芥：將種子點在基質上(腐殖土∶蛭石=2∶1)，封上保鮮膜。轉移到 23 ℃恒溫培養(yǎng)室中，10 d后去除保鮮膜，生長4周后備用。

擬南芥皿內接菌：將實驗室保存的寄生疫霉菌株(1121)挑到5%固體CA培養(yǎng)基上，于23 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～4 d。將固培好的寄生疫霉菌用牙簽分割成小片，倒入5%CA液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3～4 d。在超凈臺中倒掉液體CA，浸沒在鹽溶液中，鹽培5～7 d，可用于接菌。將鹽培好的寄生疫霉菌倒掉鹽溶液，加入超純水，清洗2次，之后加入適量dH2O，放入4 ℃冰箱中30 min。之后，將鹽培的寄生疫霉菌放入23 ℃培養(yǎng)箱中，刺激30 min。于顯微鏡下觀察游動孢子情況，用血球計數板配置成濃度為 100 個/μL的孢子懸浮液。

皿內游動孢子蘸根接菌：取生長10 d的擬南芥從培養(yǎng)基中輕輕拔出，將根部置于孢子懸浮液中浸泡 15 s，將多余的液滴去除，放置于不含糖的1/2MS培養(yǎng)基中，以水處理為對照，封口后將培養(yǎng)基放于培養(yǎng)箱中。12 h后觀察表型。每個處理3次重復。

4-PBA處理：將4-PBA稀釋至1 μmol/L ，按照蘸根接菌的方法，用4-PBA處理擬南芥皿內接種寄生疫霉游動孢子12 h后的根部，12 h后在熒光顯微鏡下用紫外線或者藍光觀察并測量其鮮質量和收樣。同時，用1 μmol/L 4-PBA溶液和相應的對照溶液噴灑處理培養(yǎng)6周的擬南芥活體植株， 并于處理后3 d、5 d和10 d對植株的生長表型進行觀察。每個處理3次重復。

1.2 取樣稱量及 RNA提取

收取蘸取無菌水5 d苗齡的擬南芥野生型Col-0的根部樣品(Mock)，接種寄生疫霉菌的擬南芥根部12 h樣品(P.p)，接種寄生疫霉菌12 h后4-PBA處理的擬南芥根部樣品(P.p+Mock)。將收取好的樣品在天平上稱取各樣品鮮質量，之后于液氮中研磨至粉末狀，采用TRIZOL(invitrogen)試劑說明書的方法提取擬南芥根樣的總RNA，并用核酸蛋白微量檢測儀(Nanodrop)檢測RNA的純度。參考TaKara公司反轉錄試劑盒(Prime Script TM RT regent kit，貨號 RR047A)說明書進行：根據測定好的RNA濃度，計算出反轉錄所需的RNA量；并反轉錄得到cDNA。

1.3 定量反轉錄PCR檢測分析

利用在線軟件(http://sg.idtdna.com/p rimer quest/ Home/Index)設計AtBIP3的qRT-PCR特異性檢測引物，以編碼擬南芥泛素綴合酶的基因(Ubiq uitin-carrier enzymes 9,AtUBC9)為內參基因，檢測寄生疫霉菌定殖量的寄生疫霉菌WS014(PPTG_09948)為檢測基因(表1)。qRT-PCR檢測采用LightCycler 480實時熒光定量PCR儀(LightCycler 480, Roche), 使用SYBR GreenI染料(Roche, 德國)。qRT-PCR體系(20 μL)，ddH2O 7.4 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL，模板1 μL(終濃度為10 ng/μL)。qRT-PCR程序：95 ℃預變性 10 min；95 ℃變性15 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸45 s，40個循環(huán)。基因相對表達量的計算采用2-ΔΔCt法。每個處理3次重復。

表1 qRT-PCR所用引物序列Table 1 Primers used in qRT-PCR

2 結果與分析

2.1 4-PBA可緩解由寄生疫霉菌侵染而誘導產生的植物內質網應激

相比對照植株，接種寄生疫霉菌的植株鮮質量下降約60%(圖1-A)，說明植物在病菌侵染時呈現明顯的生長受阻表型；而寄生疫霉菌和4-PBA共處理的植株鮮質量下降約40%(圖1-A)，說明4-PBA在一定程度上可緩解病菌侵染引發(fā)的植物生長受阻表型。

A.10 d苗齡的擬南芥野生型Col-0植株分別進行寄生疫霉菌游動孢子蘸根接種和對照處理，接菌12 h之后又進行1 μmol/L 4-PBA和對照處理，對植株的鮮質量在處理后12 h進行測量和分析。結果代表3次生物學重復試驗的均值±標準誤。每組選取20棵左右的植株進行分析。使用t檢驗進行差異顯著性驗證(“*”代表P-value<0.05，有顯著差異，“**”代表P-value<0.01，有極顯著差異)B.qRT-PCR分析UPR標記基因 BiP3的表達水平。兩周苗齡的擬南芥Col-0根部進行寄生疫霉菌游動孢子接菌和對照處理，并于接菌3 h后進行1 μmol/L 4-PBA和對照處理，并于處理12 h收取根樣，提取總RNA。結果代表3次生物學重復試驗的均值±標準誤。使用t檢驗進行差異顯著性驗證(“*”代表P-value<0.05，有顯著差異，“**”代表P-value<0.01，有極顯著差異)A.Ten-day-old Col-0 seedlings were dip-inoculated by P.parasitica zoospores or treated with mock solution and thereafter followed with the treatment of 1 μmol/L 4-PBA at 12 hpi. Plant biomass was determined at 12 h post treatment. Data presentthree independent experiments±SE. For each experiment, 20 plants were analyzed per treatment. Asterisks indicate significance at P<0.05(*) and P<0.01(**) analyzed by student’s t-testB.The expression levels of UPR marker gene BIP3 were evaluated by qRT-PCR. Two-week-old A.thaliana Col-0 plant roots were dip-inoculated by P.parasitica zoospores or treated with mock solution and followed with the treatment of 1 μmol/L 4-PBA at 3 hpi. Total RNA was extracted from 4-PBA/mock treated roots at 12 h. Data presentthree independent experiments±SE.Asterisks indicates significant differences at P<0.05(*) and P<0.01(**) analyzed by student’s t-test圖1 4-PBA可緩解寄生疫霉菌侵染引起的植物生長受阻及內質網應激信號的誘導激活擬南芥野生型Col-0植株鮮質量的測量Fig.1 4-PBA attenuates plant growth retardation and ER stress response induced upon infection with P.parasitica fresh mass analysis on A.thaliana Col-0 seedlings

qRT-PCR結果表明，編碼蛋白折疊伴侶的BiP3表達水平被寄生疫霉菌顯著誘導上調(圖1B)[8]，而4-PBA在一定程度上減弱BiP3被寄生疫霉菌誘導表達的水平(圖1-B)。4-PBA可緩解寄生疫霉菌侵染而誘導產生的植物內質網應激。

2.2 4-PBA顯著減輕寄生疫霉菌對植物組織的侵染程度

接種寄生疫霉菌的擬南芥植株根部明顯被菌絲覆蓋，相比而言，處理4-PBA后明顯減少菌絲在寄主植物根部上的擴展(圖2-A)。

A.10 d苗齡的擬南芥Col-0植株根部首先進行寄生疫霉菌游動孢子接菌，并于接菌6 h后分別進行1 μmol/L 4-PBA和對照處理。處理后的植株放置于1/2 MS培養(yǎng)基生長3 d后病菌的侵染及擬南芥植株的生長狀態(tài)觀察B.分別選取不同處理中20棵幼苗進行葉片褪綠黃化統(tǒng)計分析。結果代表3次生物學重復試驗的均值±標準誤。使用t檢驗進行差異顯著性驗證(“**”代表P-value<0.01，有極顯著差異)A.Ten-day-old Col-0 roots were dip-inoculated by P.parasitica zoospores and followed with the treatment of 1 μmol/L 4-PBA and mock solution at 6 hpi. After treatment of 4-PBA/mock solution, seedlings were grown on 1/2MS medium for 3 d and followed with the observation of P.parasitica infection and plant growth phenotypeB.Twenty seedlings from different treatments were used to analyze the ratio of leaf chlorosis. Data present three independent experiments±SE. For each experiment, 20 plants were analyzed per treatment. Asterisks indicates significance at P<0.01(**) analyzed by student’s t-test圖2 4-PBA顯著減輕寄生疫霉菌對植物組織的侵染Fig.2 4-PBA attenuates colonization of P.parasitica on plant tissue

通過進一步統(tǒng)計和分析擬南芥幼苗葉片的褪綠黃化率可發(fā)現，相比寄生疫霉菌侵染引起的植株褪綠黃化，處理4-PBA能夠明顯抑制植株萎黃死亡的表型(圖2-A)，并顯著降低由寄生疫霉菌侵染導致的植株萎黃死亡率(圖2-B)。由此說明，內質網應激的發(fā)生能夠影響植物與疫霉菌的親和互作，4-PBA可能通過緩解由寄生疫霉菌侵染引發(fā)的植物內質網應激，進而減輕病菌對植物組織的侵染程度。

2.3 4-PBA可抑制寄生疫霉菌在植物體內的擴展和定殖

相比寄生疫霉菌在根組織細胞內形成吸器并產生大量的菌絲體(圖3-B)，4-PBA的處理使得根部細胞中寄生疫霉菌吸器的形成以及菌絲的擴展被明顯抑制(圖3-A)，揭示了4-PBA能夠影響寄生疫霉菌在植物體內的定殖和擴展。

10 d苗齡的擬南芥Col-0植株根部首先進行寄生疫霉菌游動孢子接菌，并于接菌6 h后分別進行1 μmol/L 4-PBA和對照處理。 A-D.處理12 h后在熒光顯微鏡下觀察不同處理下病菌的侵染情況。標尺=50 μm。E.處理12 h后的根樣用于提取總RNA，利用寄生疫霉菌管家基因WS014引物和擬南芥UBC9引物進行qRT-PCR，定量分析寄生疫霉菌的生物量。數據表示4-PBA處理相比于對照處理下，寄生疫霉菌的相對生物量。結果代表3次生物學重復試驗的均值±標準誤。使用t檢驗進行差異顯著性驗證(“**”代表P-value<0.01，有極顯著差異)Ten-day-old Col-0 roots were dip-inoculated by P.parasitica zoospores and followed with the treatment of 1 μmol/L 4-PBA and mock solution at 6 hpi. A-D.After 12h post 4-PBA treatment, the colonization of P.parasitica were observed under epifluorescence microscope. Bar=50 μm.E.After 12h post 4-PBA treatment, the roots were harvested for total RNA extraction. Using the primers of P.parasiticaWS014 and A.thaliana UBC9, qRT-PCR was employed to quantitate the biomass of P.parasitica. The ordinate indicates biomass of P.parasitica in 4-PBA treated seedlings relative to that in mock treatment seedlings. Data presentthree independent experiments±SE. Asterisks indicates significance at P<0.01(**) analyzed by student’s t-test圖3 4-PBA能夠減輕寄生疫霉菌在擬南芥根部的擴展和定殖Fig.3 4-PBA alleviates colonization of P.parasitica on A.thaliana roots

通過實時定量PCR分析了不同處理下寄生疫霉菌定殖于植物根組織中的生物量。與熒光顯微鏡觀察結果相一致，可見相比寄生疫霉菌和對照溶液共處理的根部組織，寄生疫霉菌和4-PBA共處理的根部呈現出顯著減少的寄生疫霉菌生物量(圖3-E)，說明4-PBA能夠抑制寄生疫霉菌在植物根部組織中的定殖生物量。

2.4 4-PBA不影響植物正常的生長表型

與對照相比，濃度分別為0.1 μmol/L、0.5 μmol/L和1 μmol/L的 4-PBA處理后1 d、3 d和5 d的擬南芥幼苗呈現出正常的生長表型(圖4-A)，并且植株鮮質量并無明顯差異(圖4-B)。

A-B.生長于1/2MS培養(yǎng)基2周的擬南芥Col-0根部分別進行0.1 μmol/L 、0.5 μmol/L和1 μmol/L 4-PBA處理和對照處理，并于處理后1 d、3 d和5 d對幼苗的生長表型進行了觀察和記錄；對植株的鮮質量在處理后1 d、3 d和5 d后分別進行了測量和分析。結果代表3次生物學重復試驗的均值±標準誤。每組試驗中選取20棵左右的植株進行分析。使用t檢驗進行差異顯著性驗證(“N.S”代表無顯著差異)。C.6周苗齡的擬南芥Col-0活體植株噴施1 μmol/L 4-PBA和對照溶液，并于處理后3 d、5 d和10 d后進行生長表型觀察和記錄A-B.Two-week-old A.thaliana Col-0 roots were treated with 0.1 μmol/L ,0.5 μmol/L and 1 μmol/L 4-PBA as well as respective mock solution. The growth phenotype of seedlings was observed and recorded at 1d, 3d and 5d post treatment and the seedlings’ fresh mass was measured and analyzed at indicated time points. Data present three independent experiments±SE. Twenty seedlings were analyzed in each group of experiment. N.S. indicates no significance analyzed by student’s t-test.C.Six-week-old A.thaliana Col-0 plants were spray-treated with 1 μmol/L 4-PBA and mock solution. The plant growth phenotype were observed and recorded at 3 d, 5 d and 10 d post treatment圖4 4-PBA不影響植物正常的生長表型Fig.4 4-PBA does not affect the plant growth phenotype

此外，還用1 μmol/L 4-PBA溶液和相應的對照溶液噴灑處理6周大的擬南芥活體植株，并于處理后3 d、5 d和10 d對植株的生長表型進行觀察，結果發(fā)現：和對照處理相比，1 μmol/L的4-PBA處理的擬南芥植株生長表型并沒有明顯變化(圖4-C)。上述結果表明，適當濃度的4-PBA并不會影響植物正常的生長表型。

3 討 論

內質網是真核細胞中最為重要的細胞器之一，是蛋白質合成與折疊以及翻譯后修飾、脂類和固醇合成、維持Ca2+動態(tài)平衡的關鍵功能位點。在哺乳動物研究中發(fā)現，當內質網功能處于紊亂狀態(tài)時，會誘發(fā)內質網應激，產生一系列細胞反應，參與多種神經退行性疾病的發(fā)生與發(fā)展[17]。相比而言，盡管植物的內質網應激及UPR信號機制仍有待深入研究，已有研究揭示了內質網在植物對病原菌的免疫應答中具有中心調節(jié)作用，當其正常功能被干擾或破壞時，會促進病菌入侵寄主細胞[4,12,18]。因此，提高內質網功能的穩(wěn)定性并探索內質網應激的發(fā)生機制對于增強作物逆境適應性，并推進綠色可持續(xù)農業(yè)生產具有重要的科學意義。

最近的研究發(fā)現，擬南芥在響應寄生疫霉菌早期侵染時，其內質網應激信號通路被誘導激活[12]。本研究結果顯示，相比于對照處理中擬南芥植株的健康生長表型，寄生疫霉菌侵染24 h的擬南芥Col-0植株呈現出明顯的生長受阻表型(圖1-A)，該生長敏感表型進一步證實寄生疫霉菌的侵染能夠引發(fā)植物細胞內質網應激的產生。由此可推測：病菌誘導植物細胞產生的內質網應激可能有助于病菌對寄主植物的成功侵染。

分子伴侶4-PBA是一種短鏈芳香族脂肪酸，在哺乳動物研究中發(fā)現，4-PBA能夠有效緩解衣霉素和毒胡蘿卜素等應激化學誘導劑引發(fā)動物細胞產生的內質網應激[19]。同時，研究證明4-PBA可減輕原代背根神經結神經元高糖血癥誘導的氧化應激和細胞凋亡，但并不改變細胞活力和鈉通道的表達[5]。然而，內質網應激修復劑4-PBA對植物抵御病原菌侵染的影響及其在植物與微生物互作中的功能研究鮮有報道。本研究結果表明，4-PBA不僅能夠緩解由寄生疫霉菌侵染引發(fā)的植株生長受阻的表型(圖1-A)，還明顯減弱寄生疫霉菌早期侵染引起的內質網應激信號標記基因AtBiP3的誘導表達水平(圖1-B)，揭示分子伴侶4-PBA對于寄生疫霉菌侵染而誘導產生的植物內質網應激具有一定程度的修復和緩解作用。

而4-PBA能夠顯著減輕寄生疫霉菌對植物組織的侵染以及植株的萎黃死亡率(圖2-A, 2-B)，揭示內質網應激的發(fā)生可能是促進病菌侵染的關鍵因素。最近的研究也證實內質網應激感應因子bZIP60和bZIP28缺失的擬南芥突變體對寄生疫霉菌呈現感病表型[12]。因此，推測4-PBA可能通過緩解病菌引發(fā)的內質網應激，維持ERQC的穩(wěn)定，從而促使植物的免疫系統(tǒng)得到恢復，以更有效地抵御病菌的入侵。同時，4-PBA能夠抑制寄生疫霉菌在植物體內的擴展和定殖(圖3)，該結果揭示4-PBA對抑制寄生疫霉菌的定殖和擴展也具有重要作用。

值得注意的是：適當濃度的4-PBA對擬南芥幼苗的生長及鮮質量并無顯著影響(圖4-A，4-B)，并且對活體植株的正常生長也無明顯影響(圖4-C)，這說明4-PBA對植物的生長并無化學藥劑的負效應，也證明其在作物抗病以及綠色可持續(xù)農業(yè)生產中具有良好的潛在應用價值。

綜上所述，本研究證實內質網應激修復劑4-PBA在不影響植物正常生長的同時，不僅能夠緩解寄生疫霉菌誘導產生的植物細胞內質網應激，還對寄生疫霉菌在植物體內的擴展和定殖具有抑制作用。因此，4-PBA作為一種內質網應激修復劑，有望作為一種新型的藥物靶點應用于作物疫霉屬卵菌病害的綠色綜合防控，同時也為探索綠色和可持續(xù)發(fā)展的抗病新途徑提供了新思路。