1-MCP結合低溫通過調控脆性、葉綠素降解緩解葉類蔬菜采后衰老

李雪瑞，李 宏，馮艷芳，普紅梅，楊 芳，金鵬程，王海丹，于麗娟

(1.云南省農業科學院 農產品加工研究所，昆明 650205；2.云南農業大學 熱帶作物學院，云南普洱 665000)

葉菜是以菜葉和葉柄為食用部分的蔬菜，含有富碳水化合物、維生素和無機鹽等營養成分，是種植面積最廣、品種最多、消費量最大的一類蔬菜。但因該類蔬菜具有葉表面積大、含水量高、組織脆嫩等特點，采后水分蒸發快，易受機械損傷，呼吸作用旺盛，細胞膜被破壞，影響了其采后電導率、MDA值的變化，同時組織的傷愈合產生萎蔫、軟化[1]，影響葉菜的脆度及其β-GAL酶活性，通過影響脫鎂葉綠素酶(PPH)酶含量、葉綠素酶(CLH)酶含量影響葉綠素的降解[2]，導致葉菜褐變、黃化，這3個問題使得葉菜成為生鮮農產品中最難保鮮的一類產品[3]。因此，采取有針對性的采后貯藏保鮮技術對降低采后損失和提高質量都具有重要意義。

生菜(lettuce)即葉用萵苣，菊科，萵苣屬，1～2 a生草本，綠葉菜類蔬菜，以葉球或葉片供食用，宜生食，故稱生菜。生菜營養豐富，是一種低熱量、高營養的蔬菜。生菜采收后，由于旺盛的呼吸作用和蒸騰作用，易失水、萎蔫、褐變，同時由于生菜極富脆性且含水量高，在收獲、運輸及存儲過程中，易受損傷，更加速其品質的下降[4]。對于生菜保鮮的研究一直以來都很多，余江濤等人對生菜保鮮方法進行了綜述，有物理保鮮方法(真空預冷保鮮、包裝膜及氣調保鮮、低溫保鮮、熱處理、光照、輻照、高壓保鮮)，化學保鮮(消毒劑清洗、化學保鮮劑)，生物保鮮(生物殺菌劑、天然提取物)等[5]，葉類蔬菜保鮮也大體都是這些技術[6-7]。姜文利等[8]研究了低溫加濕保鮮對生菜貯藏品質的影響，有研究者研究了不同包裝材料對生菜采后生理及保鮮效果的影響[9-10]。瓢兒菜由蕓薹進化而來，被稱為“維他命”菜，常吃可以預防便秘，增強人體防病抗病的能力，但在貯藏銷售過程中易受溫度、微生物等影響發生黃化萎蔫、腐爛，是采后損失較嚴重的葉菜之一[11]。謝晶等[12]建立了以時間、溫度和品質指標值為變量的瓢兒菜貨架期預測方程，擬定不同的品質終點值能得到對應的貨架期，測定了在 5、10、15和20 ℃ 4個溫度下貯藏的瓢兒菜的還原型抗壞血酸、葉綠素、顏色參數 L*(亮度)、b*(黃度)、△E(色差)和感官評價，具體的保鮮方法研究較少。高建曉等[13]研究了6-芐氨基嘌呤處理對瓢兒菜貯藏品質的影響。曾順德等[14]研究了4 ℃冷藏下普通PE袋、4孔OPP自粘袋、微孔氣調保鮮袋對瓢兒菜保鮮效果的影響。但保鮮方法對葉菜的作用機制還不得而知。

溫度是果蔬貯藏保鮮中極為關鍵的一個因素。適宜的低溫可以抑制采后病原菌的繁殖和生長[15]。果蔬低溫貯藏技術是通過降低溫度來抑制果蔬呼吸，延緩生命活動，達到保鮮的效果[16]。同時，乙烯是促進成熟的重要激素，而1-甲基環丙烯(1-MCP，1-Methylcyclopropene)可以阻斷乙烯的合成，降低其呼吸速率，達到緩解成熟與衰老的效果，從而延長其產品保鮮期與貨架期[17]。目前，有關1-MCP應用于果蔬保鮮的研究報道日益增多。研究表明，1-MCP處理常與低溫、氣調及其他保鮮劑等聯合使用，在果蔬貯藏過程中取得了明顯的效果[17-18]。前人研究結果表明：1-MCP能保持葉類蔬菜較高的葉綠素和Vc含量，延緩衰老進程[19]。因此，本試驗在研究葉類蔬菜保鮮效果的基礎上，探究低溫(4 ℃)條件下，不同濃度1-MCP處理對葉類蔬菜采后品質的影響及酶活變化，為進一步利用采后處理技術延長葉類蔬菜貯藏期提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

原材料：生菜(意大利生菜)和瓢兒菜(瓢兒菜)，2種帶根活體葉類蔬菜，購于云南省農業科學院農產品加工研究所農產品展示平臺；剔除有機械損傷、病蟲害的個體，選擇大小一致的個體常溫放置；定期取樣測定相關指標。

試劑：1-MCP (1-甲基環丙烯)(≥4.0%，上海麥克林生化科技有限公司)；2-硫代巴比妥酸(上海展云化工有限公司)；丙酮(分析純，四川西隴科學有限公司)。

儀器：MULTISKAN GO酶標儀(賽默飛世爾科技有限公司)；5424R離心機(德國Eppendorf公司)；TMS-TOUCH質構儀 (美國FTC公司)；BSA223S電子分析天平(德國Sartorius公司)；DK-98-Ⅱ電熱恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 保鮮處理 將生菜和瓢兒菜兩種葉類蔬菜分別置于4、6 μL/L的1-MCP環境中密閉熏蒸24 h，將樣品取出后用保鮮袋包裝，不束口，分別置于常溫及4 ℃條件下貯藏。貯藏期間定期取樣，測定相關指標含量變化。

1.2.2 失水率的測定 取樣后測定樣品初始質量，之后分別貯藏24、48 h后測定樣品質量，按下式計算失水率。

失水率=(m0-m)/m0×100%

式中：m0為樣品貯藏前的質量(g)，m為樣品貯藏后的質量(g)。

1.2.3 相對電導率的測定 用打孔器將樣品制成厚薄均勻，大小一致的組織圓片，精確稱取 2 g放在盛有20 mL蒸餾水的燒杯中，振蕩后浸泡 1 h，測定提取液電導率C1；測定后煮沸5 min，冷卻后加蒸餾水補充至20 mL，測定電導率C0；按下式計算相對電導率。

Le=C1/C0×100%

1.2.4 MDA的測定 稱取樣品2 g，加入三氯乙酸5 mL，冰浴研磨、離心，取上清即為 MDA提取液。取2 mL MDA提取液，加2 mL 2%硫代巴比妥酸，混勻后放置于100 ℃水浴中保溫30 min，靜置冷卻后于波長 450、532和 600 nm下測定吸光值。按下式計算MDA的質量摩爾濃度。

C=6.45×(A532-A600)-0.56×A450

1.2.5 脆性測定 利用質構儀以單刀剪切模式測定兩種葉菜脆性。測量最大剪切力(N)和最大位移(mm)，用曲線斜率表示其脆性，即斜率(脆性)=最大剪切力/最大位移，斜率越大，說明樣品的硬度或脆性越大，反之則越小。測定參數設置為0.1 N的起始力，40 mm/s的測試速度， 10 mm的回程距離。

1.2.6 葉綠素含量的測定 取0.5 g樣品，用提取液(丙酮∶乙醇體積比為2∶1)研磨、過濾、定容至25 mL。以提取液為對照，測定 663、645 nm處的吸光值。按下式計算葉綠素含量(mg/g)。

葉綠素總含量=(20.20×A645+8.02×A663)×V/(100×W)

式中：V為提取液體積，W為樣品鮮質量。

1.2.7 β-半乳糖苷酶(β-GAL)酶活性，葉綠素酶(CLH)及脫鎂葉綠素酶(PPH)酶含量的測定 取0.1 g生菜及瓢兒菜組織鮮樣，加入提取液冰浴研磨，高速離心后取上清液分別采用β-GAL酶活性測定試劑盒(蘇州科銘生物技術有限公司)，CLH酶含量測定試劑盒(上海酶聯生物科技有限公司)及PPH酶含量測定試劑盒(上海酶聯生物科技有限公司)，參照試劑盒說明書測定各酶的活性。測定400 nm處的吸光度值，以每克組織每分鐘產生1 nmol對-硝基苯酚定義為1個β-GAL酶活性單位。在450 nm波長下分別測定吸光度值，根據標準曲線y=0.008 6x+0.053 2(R2=0.998 8；其中，x均為濃度，y均為吸光度值)計算樣品中植物CLH酶含量，根據標曲y= 0.019 9x+0.245 9(R2=0.999 4；其中x為濃度，y為吸光度值)計算PPH酶活含量。

1.2.8 數據分析 采用Excel 2010軟件處理數據，SPSS20.0軟件進行標準差及差異顯著性分析(當P<0.05時，認為差異顯著)，Origin 2018軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 4 ℃+1-MCP對2種葉菜失水率的影響

水分是保持果蔬新鮮的重要因素，新鮮生菜中水分含量很高，一般在90%～95%[20]，瓢兒菜葉片肥厚，常溫儲藏3～4 d就會黃化萎蔫[14]。伴隨著呼吸作用和蒸騰作用，果蔬采后水分不斷散失，重量不斷下降，且切割之后葉片受到損傷，更容易失水，外在表現為萎蔫、皺縮、質量下降。由圖1可以看出，常溫條件下兩種葉類蔬菜均快速失水，貯藏4 d后樣品嚴重萎蔫，失水率分別高達40.03%、38.05%，而4 ℃和不同濃度 1-MCP+4 ℃處理均能有效緩解葉菜失水現象，具有較好的保鮮效果。其中，4 ℃和不同濃度1-MCP+ 4 ℃處理生菜保鮮效果差異不明顯，而6 μL/L 1-MCP+4 ℃處理瓢兒菜能更有效地緩解水分散失。6 μL/L 1-MCP+4 ℃處理條件下，貯藏12 d后，兩種葉菜失水率分別為15.74%、 11.81%。曾順德研究顯示瓢兒菜在微孔氣調包裝袋中于 4 ℃下貯藏，至第9 d時，其失水率達到16%[14]，但6 μL/L 1-MCP+4 ℃處理瓢兒菜至第8天時，失水率僅為6.48%。從上可以看出，6 μL/L 1-MCP+4 ℃處理確實能有效緩解葉菜水分散失。

不同小寫字母的柱值表示各處理的平均值(n=3)在P<0.05水平上差異顯著，下同。Values on columns followed by different lowercase letters indicate averages(n=3) of different treatments at level of P<0.05,the same below.圖1 2種葉菜在貯藏過程中的失水情況Fig.1 Water loss rate in two kinds of leafy vegetables during storage

2.2 4 ℃+1-MCP對2種葉菜膜透性的影響

電導率的大小可以反映細胞膜的完整性和果實的衰老程度。由圖2-A可以看出，貯藏過程中，兩種葉類蔬菜的電導率均隨貯藏時間延長呈上升趨勢；但與對照相比，4 ℃和不同濃度 1-MCP+4 ℃復合處理能夠顯著緩解電導率的升高。其中，6 μL/L 1-MCP+4 ℃復合處理，兩種葉菜電導率上升速率最慢，至第12天，分別上升至 17.41%、16.01%，對于緩解電導率上升、細胞膜透性增加均具有最佳效果。

圖2 2種葉菜在貯藏過程中電導率、丙二醛的變化Fig.2 Electrical conductivity and MDA in two kinds of leafy vegetable during storag

MDA含量作為判斷衰老程度的指標之一[21]。由圖2-B可以看出，在兩種葉類蔬菜中，常溫對照組的MDA明顯積累，貯藏4 d時，兩種葉菜的MDA分別上升至0.025、0.013 μmol/g，而經4 ℃或不同濃度1-MCP+4 ℃復合處理的樣品中MDA增加相對緩慢，該現象表明4 ℃或不同濃度1-MCP+4 ℃復合處理可以抑制MDA的積累，與電導率的變化規律相似。6 μL/L 1-MCP+4 ℃復合處理對于緩解兩種葉類蔬菜MDA上升均具有最佳效果。貯藏12 d后，兩種葉菜MDA分別為0.0037、0.0139 μmol/g，保鮮效果最佳。

2.3 4 ℃+1-MCP對2種葉菜β-半乳糖苷酶(β-GAL)酶活性和脆性的影響

β-半乳糖苷酶(β-GAL)是細胞壁降解的關鍵酶之一，其可催化果膠聚合體降解，破壞細胞壁結構，從而使果實軟化，而軟化是果蔬衰老的重要表現之一。由圖3可以看出，脆性與β-GAL酶活性呈負相關關系，β-GAL酶活性越大，葉菜細胞衰老、軟化的速度隨之增快，脆性便隨之減弱。由圖3-A可以看出，常溫貯藏下，2種葉類蔬菜β-GAL的酶活性上升速度非常快，在貯藏第4 d時，分別上升至22.85、30.91 nmol/(min·g)，上升了約2倍。而4 ℃及不同濃度1-MCP+4 ℃處理過的樣品組β-GAL酶活性上升速度都相對較慢，其中6 μL/L 1-MCP+4 ℃上升速度最慢，貯藏至第12天時，2種葉菜β-GAL酶活性分別為15.01、 19.53 nmol/(min·g)，分別上升了41.86%、 12.74%。由圖3-B可以看出，常溫條件下，2種葉菜的脆性下降最快，至第4天，下降了 82.89%、 80.12%。4 ℃及不同濃度1-MCP+ 4 ℃處理可以較好地保持兩種葉菜的脆性，減緩其衰老的速度。這與緩解電導率上升、MDA積累的作用類似。6 μL/L 1-MCP+4 ℃低溫復合處理在保持兩種葉類蔬菜脆性中的效果最佳， 12 d后，2種葉菜的脆度分別降低14.48%、 28.12%，4 μL/L 1-MCP+4 ℃處理則降低 47.60%、 40.55%。

圖3 貯藏過程中2種葉菜β-半乳糖苷酶酶活性和脆性的變化Fig.3 β-GAL enzyme activity and brittleness in two varieties of leafy vegetable during storage

2.4 葉綠素含量的變化

葉綠素降解是植物葉片衰老最明顯的標志[22]。由圖4可以看出，常溫條件下，兩種葉類蔬菜的葉綠素降解速率較快，貯藏至第4天時，分別降至0.3、0.32 mg/g，降低65.76%、 72.37%。而4 ℃及不同濃度1-MCP+4 ℃復合處理葉綠素降解均相對緩慢，貯藏12 d時，4 μL/L 1-MCP+4 ℃處理后葉菜的葉綠素則分別降低32.71%、35.55%，而6 μL/L 1-MCP+ 4 ℃復合處理后2種葉菜葉綠素含量分別為 0.68、0.82 mg/kg，各自降低23.45%、30.13%，由此可見，6 μL/L 1-MCP+4 ℃復合處理保鮮效果最佳。

圖4 2種葉菜貯藏過程中葉綠素含量的變化Fig.4 Chlorophyll content in two kinds of leafy vegetables during storage

2.5 CLH、PPH酶含量的變化

綠葉蔬菜采后失綠直接影響產品感官品質和貨架壽命。相關研究表明，CLH酶和PPH酶是葉綠素降解途徑中的關鍵酶[23-24]。由圖5可以看出，隨著貯藏時間的延長，2種葉菜中CLH、PPH酶含量都有所降低。CLH酶活變化，生菜常溫貯藏4 d后降至526.79 ng/g，降低55.99%，而6 μL/L 1-MCP+4 ℃復合處理后其CLH酶含量降低得卻很慢，至第12天，降至690.30 ng/g，降低42.33%；瓢兒菜常溫貯藏4 d后降至 600.61 ng/g，降低53.03%，其他經各處理后第12天，其CLH酶活分別降至600.75、633.62、 704.19 ng/g，分別降低53.02%、50.45%、 44.93%，由此可見6 μL/L 1-MCP+4 ℃復合處理能緩解其CLH酶的降解。PPH酶活變化，生菜常溫貯藏 4 d后，其PPH酶活降至0.06 nmol/g，降低 74.50%，其他各處理12 d時分別降低73.27%、72.05%、67.11%；瓢兒菜常溫貯藏4 d后，其PPH酶活降低52.04%，12 d時，各處理后其酶活分別降至0.08、0.09、0.10 nmol/g，降低 59.16%、55.22%、51.49%，依舊是6 μL/L 1-MCP+4 ℃復合處理其CLH酶降低最少，這表明1-MCP可以調節葉綠素降解途徑相關酶表達水平，從而延緩葉綠素降解[25]，且對于生菜和瓢兒菜來說，6 μL/L 1-MCP比4 μL/L 1-MCP的效果要好。

圖5 2種葉菜貯藏過程中葉綠素酶(CLH)、脫鎂葉綠素酶(PPH)含量的變化Fig.5 CLH and PPH enzyme content in two kinds of leafy vegetables during storage

3 結論與討論

保鮮處理后，在常溫和低溫條件下，兩個品種葉類蔬菜失水率、電導率、MDA含量均呈現上升趨勢，1-MCP結合低溫冷藏處理可以延緩電導率和MDA等含量增加的時間和速率，這剛好與李劍峰等[26]研究一致。β-半乳糖苷酶酶活性隨貯藏時間增加，脆性則不斷下降，這一現象表明β-GAL酶活性越大，葉菜細胞衰老、軟化的速度隨之增快，脆性便隨之減弱，且1-MCP結合低溫處理可以有效抑制β-GAL酶活性，進而延緩果蔬軟化的速度[27]。王森等[28]研究證實，1-MCP處理可以明顯減緩果蔬貯藏中硬度與脆度的下降，對延長果蔬貨架期具有積極作用，本試驗結果與前人研究相吻合，且1-MCP 可減緩果蔬脆度下降有可能與它能抑制β-GAL酶活性增加有關。葉綠素含量、CLH酶、PPH酶含量等隨著貯藏時間的延長均呈不同的下降，這表明1-MCP+4 ℃復合處理可以調節葉綠素降解途徑中相關酶的含量及表達水平來延緩葉綠素降解，從而在葉類蔬菜上具有較好的保鮮效果。這與前面失水率、脆性等品質正好對應，焦莉等[29]的研究發現，生菜采后使用包裝水分散失減少，所以其葉綠素降解得也相對較緩慢，這在本研究結果中也被證實，6 μL/L 1-MCP+4 ℃復合處理后其失水率最低，葉綠素降解得也最緩慢。也有研究者在探究5 ℃低溫儲藏瓢兒菜時推測葉綠素主要因為脫鎂反應而降解，低溫抑制了該反應[12,30]。曾順德等的研究表明微孔氣調保鮮袋包裝瓢兒菜貯藏9 d后，其SPAD值相比散裝對照低10.83%[14]，6 μL/L 1-MCP+4 ℃處理在抑制瓢兒菜采后黃化方面仍然顯示出其優勢，同時這為后面將氣調包裝與1-MCP、低溫結合保鮮瓢兒菜提供了思路，也為其作用機制分析做了鋪墊。蔬菜在采后貯藏過程中葉綠素合成作用停止，但代謝作用仍然旺盛，隨著貯藏時間延長，葉綠素因受CLH酶和PPH酶主導的代謝途徑的影響逐漸被分解，綠色消退并逐漸黃化。CLH和PPH是脫去葉綠素a的植醇，是葉綠素降解途徑中的2個關鍵酶，能夠特異性水解脫鎂葉綠素a生成脫鎂葉綠酸a，其表達水平與衰老程度呈正相關[31]。田雪婷等[25]探討了1-MCP處理對采后“澳洲青蘋”蘋果葉綠素降解的影響，發現1-MCP能夠延緩果皮黃化，這與本實驗結果一致，其認為可能是1-MCP抑制了葉綠素a,b的降解，并減少果實中脫鎂葉綠素a與脫鎂葉綠酸a含量的積累，從而達到延緩黃化的效果，1-MCP抑制葉菜葉綠素降解的具體原因需要進一步的探究。未來的研究也將集中于探究影響β-GAL酶、CLH酶、PPH酶的基因，為1-MCP+4 ℃方法保鮮葉菜提供理論依據。