IGF-1、bFGF、ITS、2-ME2對牛耳皮膚成纖維細胞細胞周期的影響

孟曉俁，劉 欣，孫 羽，張廣輝，張 涌

(西北農林科技大學 動物醫學院，陜西楊凌 712100)

影響體細胞核移植效率的因素有很多，其中供體細胞核不完全重編程是影響體細胞核移植效率最重要的因素。處于不同細胞周期中的供體細胞，染色質結構和表觀遺傳修飾不同，體細胞核移植效率也不同。通常認為，G1或G0期是最適合作為體細胞核移植供體細胞的細胞周期。目前體細胞核移植程序中供體細胞一般通過血清饑餓或接觸抑制處理，讓更多的供體細胞處于G1或G0期，但是這兩種處理方法獲得的G1或G0期的細胞只占細胞總數的70%～80%，并且獲得的供體細胞容易受到損傷，因此優化供體細胞的處理方法對于完善體細胞核移植技術具有重要意義。

細胞周期分為G1、S、G2、M期。G1期還可分為G1早期和G1晚期。細胞質橋連接的兩個細胞即為eG1期細胞，有研究通過震蕩法獲取eG1期細胞[1]。G0(靜止期)細胞既不生長也不增殖。這種狀態通常由有絲分裂過程中所需物質耗竭(如血清饑餓)引起，具有特定的轉錄[2-3]和代謝[4]變化等特征。有研究發現，對于非轉基因的成纖維細胞，血清饑餓法誘導獲得的G0期細胞核移植后，足月犢牛的存活率顯著高于G1早期和G1晚期細胞。但是對于轉基因的成纖維細胞，G1期細胞核移植后重構胚發育至足月犢牛的比例相較于G0期細胞顯著升高，犢牛存活率及發育至斷奶的比例也更高。用非轉基因的eG1期細胞核移植后獲得的重構胚發育明顯優于G0和G1晚期。與G1晚期作為供體細胞時獲得的重構胚相比，eG1期細胞作為供體細胞時，1級和2級囊胚發育率更高[5]。這些研究表明，eG1期細胞是體細胞核移植最適合的細胞周期。

本試驗研究不同生長因子(2-ME2、IGF-1、bFGF、ITS)及其組合(2-ME2+IGF-1+bFGF+ITS)對細胞周期中G0/G1期細胞比例的影響，并與震蕩法聯合使用觀察獲得的細胞中eG1細胞比例，以期在短期內獲得更多數量及更高比例的eG1期細胞，為體細胞核移植提供適合的供體細胞處理方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛耳皮膚成纖維細胞(渭南華陰市草灘第一牧場，采取母牛新鮮牛耳皮膚組織分離培養)；300目細胞篩；0.22 μm濾器購自美國Millipore；小鼠抗波形蛋白(Vimentin)單克隆抗體(ab8069)購自美國Abcam；山羊抗小鼠抗體(A-21424)購自美國Thermo； DMEM/F12+GlutaMAX TM-1(1X)、Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine(ITS-X)(100X)、IGF-1、bFGF、胎牛血清均購自美國Gibco；2-ME2購自美國Sigma；二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)、胰蛋白酶(Trypsin)購自美國Amresco；DAPI、體積分數4%多聚甲醛固定液、免疫染色通透液Triton X-100、免疫染色封閉液、免疫熒光染色一抗稀釋液、免疫熒光染色二抗稀釋液均購自中國上海碧云天；生理鹽水購自中國陜西圣奧動物藥業。

1.2 試驗方法

1.2.1 牛耳皮膚成纖維原代細胞分離與培養 采用組織塊貼壁培養法分離牛耳皮膚成纖維細胞。采集牛耳皮膚組織，用含青霉素及硫酸鏈霉素的PBS反復沖洗，加入少許細胞培養液，用眼科剪剪碎皮膚組織。將組織塊間隔排布，均勻貼附在60 mm細胞培養皿中，倒置于飽和濕度、體積分數5% CO2、38.5 ℃恒溫培養箱中。待組織塊周圍液體即將蒸發完前加3 mL培養液，正置入培養箱，2～3 d后觀察細胞遷出情況并更換新鮮培養液，培養至細胞長滿后棄掉組織塊，將細胞傳代或凍存。試驗所用細胞均為F7-F11細胞。

1.2.2 牛耳皮膚成纖維細胞傳代培養 將已長滿培養皿皿底的牛耳皮膚成纖維原代細胞進行傳代培養。棄培養液，加入胰酶細胞消化液并置于培養箱消化3～4 min，用移液器吹打貼壁細胞，待所有細胞懸浮，加入細胞培養液終止消化。加入離心管，1 050 r/min離心5 min(以下離心條件均相同)，棄上清，培養液重懸細胞加入培養皿，“十字法”混勻后置于培養箱。

1.2.3 震蕩法獲取牛耳皮膚成纖維G1期細胞 復蘇細胞至24孔板，用含體積分數10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)的DMEM/F12的細胞培養液培養，待細胞匯合度達90%后傳代，傳代后匯合度達到80～90%時將細胞傳代至35 mm細胞培養皿。24 h后，鏡下觀察細胞狀態及匯合度。棄原培養液，加DPBS洗1～2次，分別對細胞進行不同的處理：對照組為添加培養液繼續培養細胞，處理組為向培養液中分別添加1 μmol/L 2-ME2(2-ME2)、20 ng/mL IGF-1(IGF-1)、10 ng/mL bFGF(bFGF)、ITS(ITS)及4種細胞因子組合(2-ME2+ IGF-1+ bFGF+ ITS)，培養細胞2 h，將培養皿置于渦旋振蕩器上于7檔震蕩2 min。收集培養液，離心后棄上清，用培養液重懸混勻，血球細胞計數板計數。

1.2.4 流式細胞術檢測細胞周期 當60 mm細胞培養皿中細胞匯合度達60%時，消化后離心并收集細胞，PBS洗3次。體積分數4%多聚甲醛 4 ℃過夜固定細胞，離心后棄上清，PBS洗3次。500 μL Triton-X 100透化液室溫孵育30 min，PBS洗1次。生理鹽水避光稀釋DAPI至3 μg/mL后加至管內重懸細胞，PBS洗1次，加500 μL PBS重懸，用300目細胞篩過篩至流式管內，上機。

1.2.5 牛耳皮膚成纖維細胞的免疫熒光鑒定 牛耳皮膚成纖維細胞匯合度達到80%左右時，棄原培養液，PBS洗2次，加入體積分數4%多聚甲醛溶液4 ℃過夜固定，PBS洗3次；加Triton-X 100透化液，室溫孵育30 min，PBS洗3次，用免疫熒光封閉液室溫封閉2 h，吸棄上清，小鼠抗Vimentin單克隆一抗(1∶1 000)4 ℃過夜孵育；PBS洗3次，山羊抗小鼠二抗(1∶500)室溫孵育2 h，PBS洗3次后參照“1.2.4”進行DAPI染色，將細胞置于熒光倒置顯微鏡DAPI激發光下拍照。

1.3 數據處理

所有數據用SPSS 20.0進行統計分析，結果用“平均數±標準差”表示。流式細胞儀結果分析使用FLOW JO 10.7.1軟件，柱狀圖使用EXCEL 2019軟件制作。

2 結果與分析

2.1 牛耳皮膚成纖維原代細胞的分離培養

牛耳皮膚組織塊貼壁培養11 d后，鏡下觀察牛耳皮膚成纖維原代細胞呈長梭形(圖1)。

圖1 牛耳皮膚成纖維細胞顯微圖Fig.1 Microscopic image of bovine ear skin fibroblasts

2.2 牛耳皮膚成纖維細胞免疫熒光鑒定

選取F7代牛耳皮膚成纖維細胞鋪于24孔板進行免疫熒光染色，細胞純度可達100%(圖2)。在熒光倒置顯微鏡下可觀察到明場下牛耳皮膚成纖維細胞為長梭形，牛耳皮膚成纖維細胞胞質中的波形蛋白為成纖維細胞的主要標志物，染色后呈紅色熒光，DAPI著色的細胞核呈藍色熒光。

Bright field表示牛耳皮膚成纖維細胞的明場圖； DAPI表示DAPI著色的細胞核呈現的藍色熒光； Vimentin表示對牛耳皮膚成纖維細胞染色后的胞質中的波形蛋白呈現的紅色熒光；Merge是合并圖Brightfield represents bovine ear skin fibroblasts under brightfield; DAPI represents the blue fluorescence of the nucleus colored by DAPI; Vimentin represents the red fluorescence of vimentin in the cytoplasm of bovine ear skin fibroblasts; Merge is the merged image圖2 牛耳皮膚成纖維細胞免疫熒光鑒定Fig.2 Immuno fluorescence identification of bovine ear skin fibroblasts

2.3 不同細胞因子對G0/G1期細胞的影響

流式細胞儀檢測細胞周期發現(圖3)，相同處理時間內， 2-ME2處理組G0/G1期細胞比例相較其他組顯著增加(P<0.05)，其他組間無顯著差異。

*表示差異顯著(P<0.05)；Control為對照組，下同* means significant difference (P<0.05); Control is the control group,the same below圖3 G0/G1期細胞所占比例 Fig.3 Proportion of cells in G0/G1 phase

2.4 不同細胞因子聯合震蕩法對G1期細胞的影響

用血球細胞計數板分別對震蕩所得細胞進行計數結果顯示(圖4)，在相同處理時間內，2-ME2處理組 eG1期細胞較其他組顯著增加(P< 0.05)，其他組間無顯著差異。

圖4 eG1期細胞所占比例Fig.4 Proportion of cells in eG1 phase

3 討論與結論

目前，處于細胞周期中哪個階段的供體細胞最適合進行體細胞核移植尚無定論。有研究表明，對于轉基因供體細胞，源自eG1期細胞的重構胚發育明顯優于G0期和G1晚期；對于非轉基因供體細胞，源自G1期的重構胚的發育率明顯低于G0期，但胚胎移植后源自G1期的重構胚得到的克隆牛在斷奶后存活率更高[5]。處于G1期的細胞主要合成RNA和核糖體，為下階段S期的DNA復制作好物質和能量的準備，有研究發現eG1期細胞核移植后所得克隆牛的存活率提高[5]。G0期細胞處于細胞的靜止期，移入卵母細胞后能夠與其DNA復制同步，減少了核移植胚胎發育過程中染色體畸變的可能性。那么如何提供更多處于G0/G1期及eG1期的細胞，對于提高SCNT效率有重要意義。

影響細胞周期調控的因素包括細胞周期蛋白依賴激酶的磷酸化、細胞周期蛋白的產生與降解、細胞因子等。有研究發現1 μmol/L 2-ME2與震蕩法聯合作用下可以使更多的牛胎兒成纖維細胞處于有絲分裂期[6]；20 ng/mL IGF-1可以增強小鼠精源干細胞的增殖能力[7]；對從大鼠脂肪間充質干細胞中分化出成纖維細胞[8]和大鼠鞏膜成纖維[9]來說，bFGF促進細胞增殖的最佳濃度為10 ng/mL； Keenan等[10]總結了胰島素、轉鐵蛋白和硒對細胞增殖的影響，10 μg/mL胰島素+5.5 μg/mL轉鐵蛋白+6.7 ng/mL亞硒酸鹽(ITS)的組合已經成為商業上可獲得的培養基補充劑。因此本研究選擇上述細胞因子開展試驗。

2-ME2是體內雌二醇的一種代謝產物。有研究發現，2-ME2處理人慢性髓原白血病細胞后G0/G1期細胞比例增加，S期比例下降[11]。此外，隨著2-ME2濃度的升高，骨肉瘤MG63細胞的細胞周期停留在G0/G1期比例顯著性提高，而S期和G2/M期的細胞比例則顯著性下降[12]。但也有研究發現，平滑肌細胞經0～10 μmol/L 2-ME2作用24 h后，會抑制G2/M至G0/G1的轉變[13]。本研究發現，在2-ME2處理后，與對照組和其他處理組相比，G0/G1期及eG1期比例均顯著升高(P<0.05)，說明2-ME2處理2 h后，更多的牛耳皮膚成纖維細胞處于G0/G1期，筆者推測2-ME2對細胞周期的作用不僅受2-ME2濃度和處理時間的影響，也受細胞種類的影響。此外，還有研究表明BIX-01294 作為一種有效的G9a甲基轉移酶抑制劑，1 μmol/L的BIX-01294處理山羊胎兒成纖維細胞可增加G1/G0期細胞比例，后續可進一步研究[14]。

bFGF是由146個氨基酸組成的多肽，能通過旁分泌或自分泌機制發揮許多重要的生理特性，具有較強的促進細胞增殖分化的作用，與相應受體結合后可通過酪氨酸蛋白激酶系統傳遞信息并逐級放大，最終產生細胞增殖效應。有研究發現，從細胞增殖和成纖維細胞膠原蛋白的表達來看，bFGF最佳質量濃度為10 ng/mL，在該濃度下，成纖維細胞生長更快，并向細胞外基質中分泌更多的Ⅰ型膠原蛋白和Ⅲ型膠原蛋白，這可能有助于微環境的穩定[8]。此外，bFGF與細胞膜上相應的受體結合后，定位細胞核，通過RNA聚合酶I加強基因轉錄從而加速細胞G0～G1，G1～S期的轉換，促進細胞的分裂與增殖[15]。還有研究發現1、50、100、500 ng/mL的bFGF處理細胞后G1期細胞減少，S期細胞增加，進入有絲分裂的細胞數增加[16]。本研究使用10 ng/mL的bFGF處理后，G0/G1期及eG1期細胞比例無顯著變化。雖然bFGF具有促進細胞增殖的作用，但對牛耳皮膚成纖維細胞來說，bFGF處理細胞2 h可能無法推動細胞周期向G0/G1期轉變，增加G0/G1期及eG1期細胞的數量。

IGF-I是一種廣譜促分裂素，通過結合胰島素樣生長因子受體來增強鳥氨酸脫羧酶的活性，促進細胞內DNA、RNA和蛋白質的生物合成，抑制細胞凋亡，發揮很強的促有絲分裂原作用，促使細胞從G0期向G1期轉變，進而刺激cyclin D1和CDK4基因表達，促使視網膜母細胞瘤腫瘤抑制蛋白磷酸化合成cyclin E，釋放轉錄因子E2F，促進細胞從G1期向S期轉變，縮短S期時間，導致G0/G1期細胞比例顯著降低，細胞分裂的速度加快，周期縮短，促進細胞增殖[17-18]。本研究結果表明，20 ng/mL的IGF-I處理后，G0/G1期及eG1期細胞比例無顯著變化。

胰島素-轉鐵蛋白-硒是一種含有胰島素、轉鐵蛋白、亞硒酸鈉的培養基添加劑，在低血清培養基中添加可促進細胞的生長與增殖。有研究發現，將ITS-X添加至DMEM/F12、F12、DMEM、EMEM等培養液，且FBS體積分數<4%時，能夠促進各種類型細胞的生長[19]。但也有研究表明，將體積分數為1%的ITS加入體積分數為10%的FBS的培養液中能增強人耳軟骨細胞的增殖以及減少去分化，但是單獨使用卻不能促進軟骨細胞的增殖[20]。其中，胰島素通過葡萄糖轉運蛋白對哺乳動物細胞具有多效合成代謝作用，能夠促進葡萄糖和氨基酸攝取[21-22]、脂肪生成[23]、單價陽離子[24]和磷酸鹽轉運[25]、蛋白質[26-27]和核酸合成[28]，同時抑制糖原、蛋白質和脂肪的分解。轉鐵蛋白(Transferrin，Trf)是一種高度保守的血清糖蛋白，具有運輸鐵的作用。Trf作為無血清培養基必需添加的組分，可以通過與轉鐵蛋白受體相互作用，在無血清細胞培養過程中發揮重要功能。Trf能與三價鐵離子可逆性結合，調節鐵離子轉運及代謝，維持細胞內的鐵平衡及細胞生長與增殖。同時，鐵也是一種重要的胞外抗氧化劑，有助于降低氧自由基和過氧化氫對細胞的毒性。硒以亞硒酸鹽的形式存在，具有抗氧化作用。本研究結果表明，在ITS處理2 h后，G0/G1期及eG1期細胞比例無顯著變化，推測只有在低血清培養液中添加ITS才會促進細胞的生長和增殖，本研究中使用含10%FBS的培養液，其中血清含量過高可能影響ITS發揮作用。但血清是培養供體細胞最有效的生物液體之一[29]。其中的生長因子、激素等物質對成纖維細胞的生長具有重要作用，降低血清含量可能會影響細胞增殖。因此，ITS對細胞周期的影響仍需進一步探索。

2-ME2+IGF-1+bFGF+ITS處理組與對照組相比，細胞周期無顯著變化，推測4種因子對細胞的促增殖作用與對細胞周期的阻滯作用相互影響。但目前4種因子共同作用的機理仍不清楚，需要進一步研究。

本試驗通過研究細胞因子對細胞周期的調控，可在體細胞核移植過程中短時間內獲得更多G0/G1期和eG1期的供體細胞，為提高體細胞核移植效率提供了新線索。