甘加藏羊發情周期和乏情期血漿T3和T4濃度動態變化及HPOA軸 DIO2和 DIO3的表達

劉莉莉，何玉英，楊亞文，包瑩瑩，何玉琴 ，陳衛剛，葛聞博，張 霞，華道才讓

(1. 甘肅農業大學 生命科學技術學院，蘭州 730070；2. 中國人民銀行蘭州支行，蘭州 730070；3.甘肅省甘南藏族自治州夏河縣甘加鄉畜牧獸醫工作站，甘肅夏河 747199)

甘加藏羊生長在海拔2 800～3 500 m的甘南高寒牧區，是典型的季節性發情(7-9 月)哺乳動物，2.5歲開始配種，發情周期平均為(16±2)d，每年產羔1次，每胎1羔[1]，繁殖率低，極大地影響了藏區農牧業的快速發展，因此探索影響藏羊生殖生理的調控因素，對提高藏羊繁殖率具有重要的意義。動物的季節性繁殖活動受下丘腦-垂體-性腺軸[2-3](Hypothalamus-pituitary-gonadal axis，HPG)、外界光周期等環境因素共同調控[4]。甲狀腺激素(TH)包括三碘甲腺原氨酸 (Triiodothyronine, T3)、四碘甲腺原氨酸 (Thyroxine, T4) ，甲狀腺激素合成酶：Ⅱ型脫碘酶(type Ⅱ iodothyronine deiodinase,DIO2)和Ⅲ型脫碘酶 (type Ⅲ iodothyronine deiodinase,DIO3)是催化不同活性甲狀腺激素相互轉化的關鍵酶，兩者的表達變化受到光周期內在信號褪黑激素的控制[5-6]，并在光周期調控下丘腦 TH 濃度過程中起介導作用[7]。動物繁殖狀態的周期性變換與兩種脫碘酶的表達變化密切相關[8]。DIO2和DIO3這兩種酶的活性變化為T3、T4血液濃度相對穩定提供了一種可能的調節機制[9]。甲狀腺激素及其合成酶DIO2、DIO3的生理功能備受國內外學者關注。目前已有報道顯示敘利亞倉鼠和綿羊等動物在長日照(休情)條件下，下丘腦DIO2的表達顯著增加，從而上調T3局部濃度，而短日照條件下DIO2表達明顯減少，T3 下丘腦局部濃度降低[10-11]。迄今為止，有關甘加藏羊繁殖周期血漿中TH的分泌變化及催化TH合成的關鍵酶DIO2、DIO3表達規律的研究較少。故本研究以繁殖季節和非繁殖季節甘加藏羊為研究對象，應用酶聯免疫吸附法(ELISA)、實時熒光PCR技術(RT-qPCR)、蛋白免疫印跡技術(Western Blot)檢測其發情周期和乏情期血漿中T3、T4的動態變化，HPOA及甲狀腺組織中DIO2和DIO3mRNA及其蛋白的表達規律，以期探討甲狀腺激素及其合成酶對甘加藏羊生殖活動的調控及影響，為進一步闡明甘加藏羊生殖生理活動規律提供研究依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集保存

在甘加藏羊繁殖季節(7-9月)和非繁殖季節(3-4月)，于甘肅省甘南藏族自治州夏河縣甘加鄉藏綿羊養殖合作社隨機選擇2.5～3.5歲雌性健康且未孕的甘加型藏羊30只，分為間情期、發情前期、發情期、發情后期和乏情期，每組6只，跟蹤觀察2個生殖周期，以公羊爬跨、結合陰道脫落細胞圖片法鑒定其發情狀況后開始采血。試驗羊開始發情時記為0 h，0～36 h為發情期，每2 h采血1次；36～72 h為發情后期，每3 h采血1次；4～13 d為間情期，14～16 d為發情前期，間情期和發情前期每天早晚7：00各采1次血，每次采血5 mL，連續采血2個發情周期(32～38 d)；在藏羊非繁殖季節，連續采血3 d，每天采血2次；血樣經肝素鈉抗凝后，以2 400 r/min離心10 min，吸取血漿移入標記好的血清管中，置于 -20 ℃冰箱冷凍保存，備用。采用頸部局部麻醉頸動脈放血法無痛處死試驗羊，迅速取出下丘腦、垂體、卵巢、甲狀腺等組織，置于液氮中保存，后移至-80 ℃冰箱保存，備用。

1.2 甘加藏羊血漿甲狀腺激素的測定

按照ELISA試劑盒(北京，奇松生物)說明測定血漿的T3、T4 的OD值，牛血清白蛋白為陰性對照。根據各自標準品的OD值以及相對應的濃度繪制標準曲線，得到T3回歸方程y= 0.227 5x+0.037 9，T4回歸方程y= 0.007 2x+0.035 1。其中y表示OD值，x表示濃度。根據回歸方程計算不同時期T3、T4的濃度，并進行分析。所有數據以“平均數±標準差”表示，用 SPSS 22.0 軟件處理，統計血漿中不同發情周期T3、T4的濃度，并用t檢驗分析。

1.3 甘加藏羊HPOA及甲狀腺組織 DIO2、 DIO3 mRNA相對表達量的測定

嚴格按照RNA提取試劑盒(北京, TransGen)說明書進行操作，分別提取甘加藏羊發情周期和乏情期下丘腦、垂體、卵巢和甲狀腺組織中的總RNA，并按照反轉錄試劑盒(北京, TransGen)，反轉錄合成cDNA鏈。根據NCBI中綿羊DIO2、DIO3和β-actinmRNA序列進行引物設計(Primer Premier 5.0)，引物由上海生工生物科技有限公司合成(表1)。以反轉錄的cDNA為模板，RT-qPCR反應總體系為 20 μL，每個樣品設3個重復。擴增條件： 95 ℃預變性30 s；94 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸30 s，循環45次。所得相關數據用2-ΔΔCT方法進行計算，每個基因相對表達量均以內參基因為基準進行校正。所有數據用SPSS 22.0軟件進行顯著性分析。

表1 DIO2、 DIO3和β-actin基因引物序列Table 1 Primers sequences of DIO2，DIO3 and β-actin gene

1.4 甘加藏羊HPOA及甲狀腺組織DIO2、 DIO3蛋白相對表達量的測定

用蛋白裂解液(1 mL裂解液+10 μL蛋白酶抑制劑)(Bioss, 北京)提取各組織總蛋白，以BCA試劑盒(Bioss, 北京)測定濃度，于十二烷基硫酸鈉(sodium dodecy sulfate, SDS)上樣緩沖液中100 ℃水浴 10min而變性蛋白，冰上靜置5 min備用。制備12%封底膠、12%分離膠和5%濃縮膠后以6 μL上樣量進行SDS-PAGE電泳，電泳完畢對照Marker預染條帶切取DIO2(31 ku)、DIO3(30 ku)、β-actin(42 ku)對應條帶，濕轉法將分離膠上的蛋白轉移至PVDF膜(Solarbio, 北京)上，PBST(PBS + tween 20)(Bioss, 北京)洗膜20 min，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。孵育一抗(1∶500)，4 ℃過夜。PBST洗膜 4 h，37 ℃孵育二抗(1∶4 500)1 h，PBST洗膜4 h，暗室曝光成影拍照。利用Image Pro-Pius 6.0圖像分析系統進行灰度值分析，并利用SPSS 22.0軟件進行差異性分析。

2 結果與分析

2.1 甘加藏羊血漿中T3和T4濃度變化規律

檢測結果顯示，甘加藏羊在整個發情周期和乏情期血漿中T3和T4的濃度呈現動態變化，以脈沖式和波動式交替變化。如圖1所示，血漿中T4的濃度顯著高于T3(P<0.05)，T4的濃度超過T3濃度的30倍。如表2所示，T3的平均濃度在發情前期最高，在乏情期最低，各時期差異顯著(P<0.05)；T4的平均濃度在發情期最高，在乏情期最低，各時期差異顯著(P<0.05)。

h.小時；d.天；w.晚；z.早;f.乏情期h.hour; d.day; w.night; z.morning; f.anestrus圖1 甘加藏羊發情周期和乏情期血漿中T3和T4濃度變化Fig.1 Concentration changes of T3 and T4 in plasma of Ganjia Tibetan sheep during estrus cycle and anestrus

表2 甘加藏羊發情周期和乏情期血漿中T3和T4平均濃度Table 2 Average concentrations of T3 and T4 in plasma during estrus cycle and anestrus of Ganjia Tibetan sheep

2.2 甘加藏羊HPOA及甲狀腺組織中 DIO2 和 DIO3 mRNA和蛋白的表達分析

甘加藏羊發情周期和乏情期下丘腦、垂體、卵巢、甲狀腺中均有DIO2和DIO3mRNA和蛋白表達，且差異顯著(P<0.05)(圖2)。垂體、卵巢、甲狀腺中DIO2mRNA和蛋白相對表達量均大于DIO3。下丘腦(圖2-A1、A2)中DIO2mRNA和蛋白相對表達量在間情期最高，DIO3mRNA和蛋白相對表達量在發情期最高，各時期差異均顯著(P<0.05)。垂體(圖2-B1、B2)中DIO2mRNA相對表達量在發情前期最高，顯著高于其他各時期(P<0.05)，蛋白相對表達量在發情后期最高，與發情前期差異不顯著(P>0.05)，與其他3個時期差異顯著(P<0.05)；DIO3mRNA和蛋白的表達量在發情后期最高，各時期差異均顯著(P<0.05)。卵巢(圖2-C1、C2)中DIO2mRNA的表達量在發情期最高，蛋白的表達量在發情后期最高；DIO3mRNA表達量在發情后期最高，蛋白的表達量在發情期最高(P< 0.05)，各時期差異均顯著(P<0.05)。甲狀腺(圖2-D1、D2)中DIO2mRNA和蛋白的表達量在發情前期最高，DIO3mRNA和蛋白的表達量在間情期最高，各時期差異均顯著(P<0.05)。甘加藏羊HPOA軸及甲狀腺組織中DIO2和DIO3Western blot結果見圖3。

A1、A2.下丘腦；B1、B2.垂體；C1、C2. 卵巢；D1、D2. 甲狀腺。相同形狀列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)A1, A2.Hypothalamus;B1, B2. Pituitary;C1, C2. Ovary;D1, D2. Thyroid. Different lowercase letters within the same shape columns indicate significant difference between groups(P<0.05)圖2 甘加藏羊發情周期和乏情期HPOA軸及甲狀腺組織中 DIO2、 DIO3 mRNA和蛋白相對表達量Fig.2 Relative expression of DIO2， DIO3 mRNA and protein in HPOA axis and thyroid tissue inestrus cycle and anestrus of Ganjia Tibetan sheep

A.下丘腦；B.垂體；C.甲狀腺；D.卵巢A. Hypothalamus; B. Pituitary;C.Thyroid;D.Ovary圖3 甘加藏羊發情周期和乏情期HPOA軸及甲狀腺組織中 DIO2、 DIO3 Western blot結果Fig.3 Result of Western blot of DIO2 and DIO3 in HPOA axis and thyroid tissue inestrus cycle and anestrus of Ganjia Tibetan sheep

3 討 論

3.1 甘加藏羊血漿中T3和T4濃度的動態變化

研究結果顯示甘加藏羊發情周期內和乏情期血漿甲狀腺激素T3和T4的濃度呈現明顯的變化，均以波動式和脈沖式交替變化，出現多個波峰和波谷，提示甲狀腺激素對季節性繁殖動物的生殖活動具有調控作用。這與趙芹等[12]的研究結果類似，通過對綿羊進行的甲狀腺切除和注射外源T4，證實T3和T4能夠啟動和終止綿羊發情。研究發現藏羊發情周期和乏情期血漿T4的濃度均顯著高于T3，T4的濃度為T3濃度的30倍以上，主要原因可能與甲狀腺激素合成機制有關，文獻[13]顯示血液中 75%以上的 T3來自T4，其余由甲狀腺分泌。T4 脫碘變成 T3，是T3生成的主要途徑，并且T4在血漿中的半衰期為 7 d，T3半衰期為 1.5 d。

本研究發現T3的平均濃度在發情前期最高，T4的平均濃度在發情期最高，并且從第5天早上開始T3和T4的濃度均呈現上升趨勢，兩者均在15 d早上達到波峰，可能是為卵泡的發育和排卵做準備。有報道指出大鼠[14]甲狀腺激素可刺激竇前卵泡的生長和排卵，T3和卵泡刺激素PI3K/Akt 通路共同作用，促進顆粒細胞增殖，抑制顆粒細胞衰老，并且甲狀腺激素在體外卵泡發育、成熟和排卵過程中都發揮著重要作用。而T3、T4的濃度均在乏情期最低，在整個乏情期，T3和T4均以波動式分布，其濃度變化趨勢比較平緩，說明乏情期甲狀腺激素的生物學活性較低，也可能是卵巢分泌的雌二醇反饋抑制下丘腦GnRH和垂體FSH和LH的分泌，進而使甲狀腺激素分泌減少，有學者[15]指出TH 可能通過參與 GnRH 脈沖釋放的神經內分泌過程而實現對性腺系統的季節性調控，再次證實甲狀腺激素對季節性發情動物生殖的調控作用。

3.2 甘加藏羊生殖軸 DIO2、 DIO3表達變化及對藏羊繁殖的影響

有研究表明，DIO2基因在大鼠的大腦、小腦、甲狀腺和睪丸中有一定表達[16-18]，在布氏田鼠的下丘腦、大腦和小腦中也有表達[19]。DIO3基因在幼齡的西伯利亞倉鼠和成年大鼠下丘腦中均有表達[20]，在人和小鼠的肝臟、皮膚、腦、子宮、胎盤中也均檢測到DIO3的表達[21-22]。本研究結果顯示下丘腦、垂體、卵巢和甲狀腺組織中均有DIO2、DIO3的表達，且各個時期不同組織DIO2、DIO3的表達有顯著差異，下丘腦中DIO2的表達量在間情期最高，在發情前期、發情期依次呈現下降趨勢，在發情后期、乏情期呈現上升趨勢，而DIO3的表達量在發情期最高，由此推測DIO2可能對甘加藏羊的繁殖活動具有抑制作用，DIO3可能對甘加藏羊的繁殖活動具有促進作用，DIO2、DIO3參與調控季節性發情哺乳動物甘加藏羊的生殖活動。

已有報道顯示鵪鶉、敘利亞倉鼠和綿羊等在長日照(休情)條件下，下丘腦DIO2表達顯著增加，而短日照(發情)條件下DIO2表達明顯減少[23]，下丘腦中DIO3的表達在春、秋季(發情)顯著高于夏季(休情)，而且在短光照卵巢中的表達量顯著高于長光照[24]，這與本研究結果基本一致，提示DIO2、DIO3表達變化受光周期的影響，光周期通過影響褪黑素的分泌來調控下丘腦中GnRH的分泌，而下丘腦室管膜細胞中存在著催化TH轉化的關鍵酶DIO2和DIO3[22]，證實 TH可能通過參與 GnRH 脈沖釋放的神經內分泌過程而實現對性腺系統的季節性調控。對長日照動物黑線倉鼠季節性繁殖研究發現，DIO2在春秋季(發情)表達量較高[24]，與黑線倉鼠春秋季出現繁殖高峰的事實一致，也與GnRH 的季節表達模式一致，表明DIO2可能有促進調控黑線倉鼠生殖的作用。這一結果與本研究結果不一致，原因可能是物種間的特異性，光照周期對短日照和長日照繁殖動物作用機制可能不同[25]。更有研究表明[24]西伯利亞倉鼠的季節性繁殖活動與DIO2的表達無關，而與DIO3的表達有關，并且在不同年齡階段、不同性別個體中DIO2和DIO3的表達量均有所不同，再次解釋了DIO2和DIO3在不同物種間表達的差異性，但具體作用機制有待進一步研究證實。

垂體、卵巢、甲狀腺組織中，發情周期和乏情期DIO3的表達量均顯著低于各時期DIO2的表達量，主要原因可能是甲狀腺主要分泌的是甲狀腺激素T4，機體所需的T3主要來源于其他組織中T4的脫碘，而只有少量的T3直接來源于甲狀腺。DIO2能催化T4轉換為活性更高的T3，這可能需要DIO2表達量的上調和DIO3表達量的下調來完成[24]。光周期影響季節性繁殖動物垂體分泌 TSH，通過 與 TSHR 相結合并將信息傳遞到下丘腦，TSHR 的表達量增加會引起下丘腦DIO2表達的上調以及DIO3表達的下調[26]。

甲狀腺中DIO2的表達量在發情前期最高，DIO3表達量在間情期最高，各時期差異均顯著，提示DIO2和DIO3在甲狀腺中發揮調控藏羊生殖活動的功能。DIO2和DIO3的活性和濃度在控制甲狀腺合成的甲狀腺激素T3和T4的水平上至關重要，DIO3能根據機體內甲狀腺激素T4的濃度調控甲狀腺激素T3的活性，使T4的濃度正好滿足機體的局部需要，且甲狀腺激素是由甲狀腺合成并分泌，有報道指出[27]甲狀腺中存在褪黑素合成的酶AANAT和HIOMT，證明甲狀腺能自主合成褪黑素，而褪黑素的合成受光照周期的影響，但甲狀腺中沒有接受外界光照的神經肽，由此推測甲狀腺中褪黑素的合成受自身內源性光照等因素的影響，而甲狀腺自主合成的褪黑素作用于下丘腦內側基底部MEH可能對DIO2、DIO3的表達產生一定的影響，進而影響下丘腦GnRH的釋放，調控甘加藏羊的繁殖活動，具體的作用機制還有待進一步研究。

4 結 論

本研究結果表明甘加藏羊發情周期和乏情期血漿中T3、T4濃度，DIO2、DIO3mRNA及其蛋白在 HPOA和甲狀腺組織中的相對表達量呈動態變化規律，且存在一定的差異，這種表達的差異從激素和分子水平證明了 T3、T4和DIO2、DIO3參與甘加藏羊的生殖調控，為進一步研究甲狀腺激素及其合成酶對動物生殖生理活動的調控機制提供科學的參考依據。