ABC亞家族G成員2基因多態(tài)性與小兒急性淋巴細胞白血病大劑量甲氨蝶呤治療效果及腎功能損傷的關系

葛一蓉, 饒 媚, 畢 婧, 譚四海, 韓 斌

(湖北省恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院 兒童血液消化腎病科, 湖北 恩施, 445000)

甲氨蝶呤(MTX)已被廣泛用作兒童急性淋巴細胞白血病(ALL)的大多數(shù)化療方案中的抗癌劑。盡管MTX在臨床上的應用取得了成功，但仍可能會存在副作用和毒性[1]。MTX的藥代動力學、功效和毒性在不同患者間存在很大差異，這種差異可部分解釋為編碼MTX膜轉運蛋白基因的序列差異[2-3]。MTX通過三磷酸腺苷(ATP)結合盒轉運蛋白從細胞中輸出，已知MTX的外向轉運蛋白是ABC亞家族G成員2(ABCG2)[4]。由ABCG2基因編碼的P-糖蛋白在多種組織中既可作為功能屏障，又可作為外排轉運蛋白，可以影響多種抗癌藥物的藥代動力學。研究[5]顯示ABCG2基因中的變體可改變P-糖蛋白的表達和功能。腫瘤細胞中P-糖蛋白的過表達導致多藥耐藥性，并且許多抗白血病藥物(例如糖皮質(zhì)激素、蒽環(huán)霉素和長春新堿)是P-糖蛋白的底物。盡管MTX不被視為P-糖蛋白底物，但MTX單藥治療的研究[6]表明，沉默的ABCG2多態(tài)性可能影響MTX治療后的結果和毒性。本研究分析ABCG2基因多態(tài)性(rs2231137、rs2231142)對大劑量MTX(HDMTX)治療效果和毒性的影響，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2011年1月—2019年1月在本院新診斷為ALL的患兒193例。納入標準: ① DNA樣本和臨床數(shù)據(jù)具有可用性; ② 接受中國兒童白血病協(xié)作組兒童急性淋巴細胞白血病2008治療方案(CCLG-ALL 2008)者; ③ 無唐氏綜合征和既往惡性腫瘤史者。根據(jù)上述條件，本研究排除了26例不符合標準的患兒(19例患兒臨床數(shù)據(jù)明顯缺失, 1例患兒未按照CCLG-ALL 2008方案進行治療, 4例患兒在沒有進入鞏固期或完成HDMTX治療時經(jīng)歷早期復發(fā)或死亡, 1例患兒出現(xiàn)唐氏綜合征, 1例患兒出現(xiàn)既往惡性腫瘤史)，其余167例患兒隨訪時間1.0～115.0個月，中位隨訪時間為75個月。CCLG-ALL 2008治療方案經(jīng)本院倫理委員會批準。所有監(jiān)護人知情同意。

1.2 治療方法

根據(jù)年齡、白細胞計數(shù)、免疫表型、細胞遺傳學和分子畸變、強的松反應、誘導治療結束時的形態(tài)學緩解[基于柏林-法蘭克福-明斯特(BFM)臨床試驗方案風險標準]、治療結束時的微小殘留病(MRD), 將患兒分為標準風險組(SR組)和中間風險組(IR組)，并參照CCLG-ALL 2008中誘導治療和鞏固治療的方案進行治療[7]。在化療鞏固階段(第8、22、36、50天)，患兒每2周接受4次HDMTX治療。HDMTX的給藥方式為: 總劑量的10%在0.5 h內(nèi)通過靜脈內(nèi)輸注完成，剩余的90%在23.5 h內(nèi)使用(SR組的MTX劑量為2 g/m2, IR組的MTX劑量為5 g/m2)。分別在HDMTX輸注開始后42、48、54 h, 以15 mg/m2劑量進行甲酰四氫葉酸解救治療。48 h后的高血漿MTX水平(>0.25 μmol/L)定義為延長解救的指示。每天監(jiān)測血漿中MTX水平，直至低于0.2 μmol/L。連續(xù)輸注MTX 24 h以上，并在48 h收集2 mL的血液樣品。依據(jù)制造商的說明書(美國TDx Abbott Laboratories), 通過熒光偏振免疫測定MTX血漿水平。

1.3 毒性和治療效果評估

從HDMTX輸注結束到下次HDMTX周期或HDMTX輸注后14 d期間評估每個HDMTX周期后的毒性。血液毒性定義為血清血紅蛋白水平降低(貧血)、白細胞減少和血小板計數(shù)減少。肝毒性定義為血清谷氨酸-丙酮酸轉氨酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)或γ-谷氨酰轉移酶(γ-GT)水平升高。腎功能損傷定義為血清肌酐或尿素水平升高。胃腸道毒性定義為存在腹瀉、惡心、嘔吐、腸梗阻、胃腸疼痛等。根據(jù)美國國家癌癥研究所常見毒性標準4.0版對毒性進行分級。選擇鞏固期最高等級的個體毒性作為所有分析的終點。治療效果通過事件的發(fā)生情況來反映，包括任何部位的疾病復發(fā)、任何原因的死亡或第二惡性腫瘤的發(fā)生。無事件生存(EFS)定義為從化療首日至事件發(fā)生所經(jīng)歷的時間。末次隨訪時，對最終分析時沒有不良記錄結果的患兒進行檢查。

1.4 基因分型

從外周血白細胞和(或)從存檔的骨髓載玻片中分離基因組DNA。分別采用Qiagen FlexiGene試劑盒(德國Qiagen公司)和QIAamp DNA Mini試劑盒(Qiagen)從冷凍全血樣品或骨髓載玻片中提取DNA。使用限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(PCR-RFLP)基因分型方法測定ABCG2基因rs2231137、rs2231142位點的基因型，見圖1。PCR擴增在以下條件下進行: 初始變性(95 ℃, 10 min), 40個變性循環(huán)(95 ℃, 15 s), 退火(60 ℃, 1 min), 延伸(72 ℃, 1 min)和延長(72 ℃, 7 min)。rs2231137引物序列: 正向為5′-CCCAGAGTCCTTATTCTTAGCC-3′, 反向為5′-GTGCCTCCTTCACACACAG-3′。rs2231142引物序列: 正向為5′-TGTTGTGATGGGCACTCTGATG-3′, 反向為5′-ATCAGAGTCATTTTATCCACAC-3′。擴增完成后, 將限制酶HpyCH4IV加入PCR產(chǎn)物中并在37 ℃下孵育4 h, 采用溴化乙錠染色的3%瓊脂糖凝膠電泳分析RFLP。

A: ABCG2 rs2231137位點; B: ABCG2 rs2231142位點。圖1 ABCG2不同基因型的代表性PCR-RFLP分析

1.5 統(tǒng)計學分析

2 結 果

2.1 ALL患兒的臨床特征及治療結果

167例ALL患兒年齡0.5～18.0歲，中位年齡4.9歲; 男80例(47.9%), 女87例(52.1%); 免疫表型包括B細胞140例(83.8%), T細胞21例(12.6%), 雙表型2例(1.2%), 未表征4例(2.4%); SR組78例(46.7%), IR組89例(53.3%); 具有延遲的MTX間隙的周期包括0個周期92例(55.1%), 1個周期38例(22.8%), 2個周期24例(14.4%), 3個周期8例(4.8%), 4個周期 5例(3.0%); MTX的平均峰濃度(Cmax)為(72.5±54.3) μmol/L; MTX第1、2、3、4周期的平均AUC為(447.2±390.1)、(435.4±353.6)、(366.9±328.4)、(358.9±336.5) μmol/(L·h); 治療結果為首次緩解133例(79.6%), 發(fā)生事件34例(20.4%)。

2.2 ABCG2基因型分布

通過PCR-RFLP基因分型方法確定了167例患兒ABCG2的2個單核苷酸多態(tài)性(SNPs), 其基因型分布見表1。rs2231137位點和rs2231142位點的基因型分布頻率經(jīng)χ2檢驗均在HWE中(P>0.05), 說明研究人群具有代表性。

表1 ALL患兒ABCG2基因多態(tài)性的頻率(n=167)[n(%)]

2.3 ABCG2基因型與HDMTX化療毒副作用的關系

167例ALL患兒接受HDMTX化療的毒副作用以血液毒性(80.8%)為主，其次為胃腸道毒性(36.5%)、口腔黏膜炎(26.9%)、肝毒性(23.4%)和腎功能損傷(17.4%)。進一步分析ABCG2的2個SNPs與HDMTX化療毒副作用的關系，結果顯示rs2231137各基因型與HDMTX各類毒副反應的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05); rs2231142中(CT+TT)基因型個體發(fā)生腎功能損傷的風險較CC野生型提高了14.14倍，差異有統(tǒng)計學意義(OR=14.14, 95%CI為1.26～42.37,P=0.032)。見表2。

表2 ABCG2的2個SNPs與HDMTX化療毒副作用的關系[n(%)]

2.4 ABCG2基因型與治療效果的關系

為了確定所選SNPs對ALL患兒治療結果的影響，本研究進行了單變量和多變量分析，結果顯示rs2231137中(AG+AA)基因型個體的72個月EFS比GG基因型個體更差, rs2231142中(CT+TT)基因型個體的72個月EFS比CC基因型個體更差，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 ABCG2基因型與治療效果的關系

3 討 論

HDMTX在改善ALL的治愈率方面起著重要作用。然而, MTX療效存在很大的個體差異[3]。既往研究[8-9]中涉及MTX轉運體通路的基因中有多個SNPs參與了MTX的動力學和效應，但部分結果并不明確。本研究分析ALL患兒MTX的外向轉運蛋白ABCG2基因多態(tài)性與HDMTX相關毒性的關系，這些患兒均按照CCLG-ALL 2008方案接受治療，評估ABCG2基因多態(tài)性對治療效果的影響，結果顯示,ABCG2rs2231142 SNPs與腎臟損傷發(fā)生率升高有顯著相關性。這些結果與其他研究[9]報道的ABCG2rs2231142 SNPs對兒童期ALL治療結果的影響不一致，該研究并未發(fā)現(xiàn)ABCG2rs2231142 SNPs與MTX毒性相關。本研究中, MTX相關毒性在維持階段MTX劑量減少時評估，與鞏固階段相比，患兒服用的MTX劑量要低得多。目前，多項研究[9-10]調(diào)查了ABCG2基因多態(tài)性對HDMTX相關毒性的影響，但研究結果卻相互矛盾，造成這種差異的可能解釋是在HDMTX后服用葉酸會降低HDMTX引起的毒性增加的可能性。

HDMTX誘導的腎損傷發(fā)生在穩(wěn)態(tài)血漿濃度結束時或結束后不久，其誘導腎臟損傷的可能機制包括腎小管內(nèi)尿液中MTX的pH值依賴性沉淀，來自傳入小動脈血管收縮的腎灌注減少，或直接毒性導致的腎小管內(nèi)MTX攝取減少[11-12]。基于HDMTX誘導腎臟損傷的發(fā)生時間，在HDMTX輸注前、輸注中和輸注后進行堿化尿液和葉酸補救均能有效預防HDMTX誘導的腎臟損傷，支持MTX沉淀在這種毒性中發(fā)揮作用的觀點[13]。目前, rs2231142多態(tài)性在HDMTX相關腎臟損傷中的作用仍未完全明確，但研究[9]表明TT等位基因是HDMTX相關毒性傾向因子。本研究證實了rs2231142 TT基因型與HDMTX相關腎臟損傷發(fā)生概率增加的關聯(lián)。但是，也有研究[9-10]提示并未發(fā)現(xiàn)rs2231137多態(tài)性與HDMTX相關毒性之間有任何關聯(lián)，其原因可能是體外淋巴細胞酶的活性顯示，rs2231142 TT、TC基因型酶的活性分別為野生型CC活性的70%、40%, 而rs2231137 AA基因型酶的活性約為野生型GG的30%[10]。因此, rs2231142位點變異相較于rs2231137位點變異可能使ABCG2轉運能力下降更為明顯，導致更多的MTX留在胞外，進而形成MTX沉淀，誘發(fā)腎臟損傷。

近年來，多項研究[9-10]調(diào)查了ABCG2基因多態(tài)性對兒童ALL生存的影響，但結果存在很多不一致。LIU S G等[9]發(fā)現(xiàn)rs2231142可作為ALL兒童的獨立預后因素。CHANG Y H等[14]發(fā)現(xiàn)rs2231142與136例中國ALL患兒的復發(fā)風險無關，但T等位基因(TT+TC)患者的60個月EFS低于CC基因型患者。本研究發(fā)現(xiàn)具有rs2231142 T等位基因(TT+TC)型患者的72個月EFS較CC基因型患者更差[(81.5±4.6)%對比(90.2±1.8)%], 但在進一步的單變量和多變量分析中并未發(fā)現(xiàn)rs2231142與患兒的EFS具有相關性。此外，本研究的中位隨訪時間長于LIU S G等[9]、CHANG Y H等[14]研究的隨訪時間，理論上出現(xiàn)復發(fā)的例數(shù)要增多，因為復發(fā)往往發(fā)生在后期許多低風險的患者中[15]。因此，目前的結果可能表明ABCG2基因多態(tài)性不是反映ALL兒童存活的有用標志物，應進一步驗證rs2231142與EFS的相關性。

本研究是一項回顧性研究，在MTX轉運途徑中僅選擇ABCG2外向轉運蛋白進行分析，沒有包括其他內(nèi)向和外向蛋白，并且樣本量有限。考慮到上述不足，本研究最小化了臨床數(shù)據(jù)收集程序的差異，因為所有患者均接受了具有可比較的CCLG-ALL 2008 治療方案和標準化的支持性護理，并且患兒的結果評估和隨訪是集中進行的。此外，本研究沒有因遺傳異質(zhì)性而產(chǎn)生偏差，因為所有受試者都是在具有種族同質(zhì)性的地理區(qū)域招募的。當然，未來仍需要在獨立隊列中進一步開展前瞻性研究以確認本研究的結果。

綜上所述, ALL患兒的ABCG2rs2231142基因多態(tài)性與HDMTX化療毒副反應中腎功能損傷相關，這可能有助于指導和優(yōu)化ALL患兒的MTX治療。