耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌對替加環素的耐藥機制研究進展

榮 芳, 吳 峰, 周 俊

(1. 揚州大學附屬醫院 呼吸與危重癥醫學科, 江蘇 揚州, 225000;2. 大連醫科大學研究生院, 遼寧 大連, 116044)

肺炎克雷伯菌(KP)為腸桿菌屬，根據毒力特點的不同，可分為普通型肺炎克雷伯菌(cKp)和高毒力肺炎克雷伯菌(hvKp)[1-2]。cKp屬于一種常見的醫院內感染病原體，是引起嚴重呼吸道感染的重要病原菌之一，容易引發消化道、皮膚、泌尿道、血液等部位感染[3], 在長期使用抗菌藥物、侵入性治療、留置導管等原因導致機體免疫力低下的人群中，機會性感染概率更高[4-5]。而hvKp在社區相關感染中更常見，壞死性肺炎、化膿性肝膿腫、內源性眼內炎、腦膜炎、脾膿腫等社區常見疾病的發生與hvKp感染有關[6]。

近年來，抗菌藥物的泛用和濫用，使得KP對β-內酰胺類、氨基糖苷類、喹諾酮類等臨床上使用頻率較高的抗生素均產生了不同程度的耐藥，多重耐藥菌成為臨床亟需攻克的難題[7]。碳青霉烯類抗生素是臨床治療多重耐藥菌的重要武器，但隨著抗菌藥物的不合理使用, KP對多種抗生素均出現了耐藥[8]。隨著碳青霉烯類抗菌藥物在臨床上的推廣使用，耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌(CRKP)的分離率逐年上升，其感染控制難度大，病死率高[9]。替加環素(TGC)作為一種極少數對多重耐藥菌有良好效能的藥物，上市后不久就發現了耐藥菌株，給臨床治療和院感防控帶來了挑戰，本文就TGC耐藥CRKP菌株(T-CRKP)的耐藥機制研究情況展開綜述，以期為預防與控制該菌的傳播和流行提供依據。

1 CRKP的流行現狀

臨床上投入使用碳青霉烯類藥物以來，耐碳青霉烯類腸桿菌科細菌(CRE)在世界范圍內的暴發和流行越來越多被報道。流行病學調查顯示，CRKP是國內外最常見的CRE, 而且由CRKP造成的患者血流感染病死率非常高。美國疾控中心(CDC)數據[10]顯示, 2001—2011年美國CRE比率從1.2%增至4.2%, CRKP分離率從1.6%增至10.4%, 2016年歐洲CDC報告顯示，歐洲國家的CRKP分離率浮動為0～66.9%。2005—2018年中國KP對碳青霉烯類的耐藥率呈持續上升趨勢，其中KP對亞胺培南和美羅培南的耐藥率從3.0%和2.9%分別上升到25.0%和26.3%; 2019年和2020年KP對碳青霉烯類的耐藥率雖然呈連續下降趨勢，但其檢出率仍超過23.0%[11], 以上數據表明中國耐藥菌株的控制情況不容樂觀。目前中國臨床CRKP流行克隆處于動態進化之中，但是在穩定遺傳情況下出現向高毒力和高耐藥方向進化的端倪，并已在全國許多地區播散，需引起高度重視。

2 CRKP對替加環素的耐藥現狀

TGC是一種半合成苷氨酰環素，為米諾環素的衍生物之一，是在米諾環素D環 C-9位置上加了側鏈，穩定性更強，不僅克服了制約四環素類抗菌療效的常見耐藥機制，還能應對多重耐藥菌的感染[12]，2005年被美國食品和藥物管理局(FDA)批準使用[13], 2019年經中國國家藥品監督管理局批準上市后投入臨床使用。體外研究[14]表明TGC對產KPC酶和金屬酶的腸桿菌科的抗菌效能達到100%。TGC不僅對腸桿菌科細菌具有廣譜高效的抗菌效能，而且對大多數革蘭陰性菌尤其是耐藥菌均具有顯著的抗菌活性，被認為是應對革蘭陰性菌多重耐藥的最后一道屏障[15-16]。

目前臨床上多以TGC、多黏菌素作為CRKP感染治療的保底用藥, 2015年由FDA批準上市的頭孢他啶/阿維巴坦也可以用來治療CRKP患者[17]。但是由于多粘菌素、頭孢他啶/阿維巴坦臨床治療費用較高, TGC仍是目前臨床治療CRKP感染的第一選擇，其應用給CRKP感染的治療帶來了顯著效果。但作為治療CRKP的最后手段, TGC的用量亦在逐步攀升，與此同時帶來的耐藥問題也日益凸顯，其上市投入臨床后不久就出現了耐藥菌株[18]。雖然全球各地的耐藥案例統計結果不盡相同，但總體上耐藥率呈逐年上升趨勢，使得KP感染幾乎陷入無藥可治的困境。

3 CRKP對TGC的耐藥機制

自TGC上市應用以來，臨床上發現的T-CRKP菌株逐漸增多。T-CRKP耐藥機制復雜多樣，近年來關于T-CRKP菌株已有相關研究，但其具體耐藥機制目前尚未明確?；仡檱鴥韧庀嚓P研究，可大致分為以下幾類。

3.1 RND型外排泵過表達

外排泵是位于細菌內膜的一種主動轉運體，細菌可以借助這個轉運體將進入胞內的抗菌藥物主動泵出細胞，通過降低抗菌藥物濃度達到耐藥的效果，其在KP中普遍存在且分布廣泛。腸桿菌科中報道較多的耐藥機制是AcrAB-Tolc和 OqxAB的過表達以及新發現的KpgABC外排泵的過表達。

AcrAB-Tolc外排泵在RND型外排泵中最常見，由外排轉運蛋白AcrAB、通道蛋白Tolc、膜融合蛋白AcrA 3個部分組成，本質上是一個質子依賴型的多藥耐藥泵，以消耗質子動力的方式將抗菌藥物從菌體排出。關于AcrAB-Tolc外排泵的研究也比較透徹，在大腸桿菌、沙門氏菌的研究中已對其機制進行了明確闡述，其作為一種抗菌藥物外排泵，對進入細菌胞內的氯霉素類、四環素類以及在漿液中發揮抗菌活性的β-內酰胺類抗生素均具有良好的識別與外排作用。先前研究[19]表明, AcrAB-Tolc外排泵中ramA、mraA、soxA、rob等調控基因表達的產物屬于AraC/XylS調控蛋白家族，可起到上調acrAB-tolC基因表達的作用，而acrR基因編碼的蛋白可下調acrAB-tolC的表達[20]。在AcrAB-Tolc外排泵的間接調控作用中,ramR、marR、soxR調控基因分別與ramA、marA、soxS的轉錄抑制因子一一對應，通過抑制acrAB-tolC上調基因的表達進而阻止外排泵AcrAB的合成來發揮負性調控作用[21]。若ramR發生基因突變、RamR表達量減少或下降，其對ramA基因產生的抑制效能就會降低, RamA的表達量會增加, AcrAB-TolC也會因此過表達。外排泵的過表達使得TGC難以進入細菌體內發揮作用，從而產生了耐藥性。

同屬于RND 家族的OqxAB外排泵，是一種由質粒編碼的蛋白產物，最早研究發現與喹諾酮類耐藥相關，現經研究證實與腸桿菌科細菌發生多重耐藥(MDR)也有一定關系。OqxAB同樣有其表達調控基因rarj與oqxR等, OqxAB的過表達可使進入菌體內多種藥物的敏感性降低，如替加環素、喹諾酮類、呋喃妥因和氯霉素等[22], 從而產生耐藥效果。

KpgABC外排泵是RND家族新成員，于2014 年被NIELSEN L E等[23]首次發現，之后JUAN C H等[24]在KP菌血癥患者中發現kpgABC基因的過表達會提升替加環素的耐藥率，且通過克隆轉化等實驗證明不需要其他外排泵的輔助也可獨立發揮排菌作用，雖然沒有達到EUCAST判斷標準，但KP對替加環素的MIC明顯增加。這一發現對T-CRKP的耐藥性研究有了新的進展，但是目前關于KpgABC外排泵的其他研究還十分有限。

3.2 四環素耐藥相關基因突變

TGC是新一代四環素類抗菌藥物，最早研究發現可有效地克服四環素類傳統耐藥機制，而AKIYAMA T等[25]研究發現沙門菌攜帶的tetA基因不僅對四環素耐藥，也會使替加環素對細菌的敏感性降低。后來有研究發現在大腸埃希菌中的Tet蛋白均可以通過突變對替加環素產生抗性。其中，TetA和TetX對替加環素產生高水平抗性，而TetK和TetM對其產生低水平抗性。研究[26]表明TetX能夠表達一種依賴于黃素的單加氧酶，這種酶可對替加環素進行羥基化修飾，使得替加環素在弱酸環境中失去穩定性而喪失抗菌活性，但是有關該基因的作用機制還未在KP中有所報道。外排泵TetA、核糖體保護蛋白TetM、以及MFS外排泵編碼基因tetL, 也被證實在一些細菌中對替加環素產生了耐藥，但是在KP中未有發現。目前僅發現T-CRKP的耐藥性與變異型和外排泵表達有關[27]。

3.3 結合位點突變

TGC的抗菌機制是通過可逆性結合細菌核糖體的30S亞基，干擾16S rRNA的A位點，從而阻斷tRNA進入核糖體A位點，終止氨基酸進入肽鏈，抑制翻譯過程，最終抑制細菌蛋白質的合成[28]。研究[29]發現30S亞基中的S10蛋白由rpsj基因表達，若rpsj基因發生改變就會使TGC的靶向作用位點缺失，細菌與抗菌藥物的結合位點發生改變從而產生耐藥。rpsj基因突變導致的細菌耐藥不同于主動外排泵耐藥機制，具有高度特異性，是多種細菌對替加環素耐藥的靶點[30]。之后HE F等[31]通過轉化互補實驗不僅證實了rpsj基因突變是導致替加環素耐藥的主要機制，而且為該基因的突變造成CRKP感染患者在使用替加環素治療期間產生耐藥首次提供直接的體內證據。

3.4 細菌細胞膜變異

細菌細胞膜主要由糖脂、磷脂和蛋白質3種物質構成?？咕镔|進入細菌體內主要是通過細菌膜上的膜孔蛋白，當膜孔蛋白基因發生突變時，膜孔蛋白的編碼數量就會減少或其結構發生改變，細胞的通透性降低，抗菌物質因難以進入細菌體內發揮作用從而產生耐藥[32]。但在大多數情況下，膜孔蛋白變異不會單獨產生耐藥菌株，往往與其他耐藥機制共同發揮作用。此外，催化磷脂合成的酶PlsC是一種跨膜蛋白，具有滲透作用[33]。PlsC基因突變會使磷脂合成受限，細菌細胞膜的通透性降低，從而使得細菌對抗生素的敏感性減弱產生耐藥[34]。

4 CR-hvKP對替加環素的耐藥機制

與cKp的高耐藥率相比, hvKp對抗菌藥物的耐藥性相對較低。目前關于hvKp菌株及其耐藥性的研究相對較少，其流行病學特征及致病性存在許多不確定性。綜合目前相關研究, CR-hvKP菌株的耐藥機制大致分為以下2類: hvKp菌株獲得性耐藥或其耐藥性通過獲得耐藥質粒產生，相關機制尚未完全明確。有研究表明, AcrB外排泵介導的耐藥在hvKp菌株中也得到了證實。HUANG Y H等[35]研究發現，hvKp菌株的外排泵基因acrB及其調控基因ramA過表達，并且由于ISKpn26序列插入AcrB的負調控基因acrR和ramR中，使得acrR和ramR發生錯義突變，導致hvKp對替加環素產生耐藥。

5 小結與展望

近年來由于細菌對廣譜抗菌藥物耐藥性的增加，曾被作為控制感染最后防線的碳青霉烯類抗生素用藥比例大幅度上升。上述關于T-CRKP耐藥機制的研究，可以為臨床防治T-CRKP提供一定的參考價值。但是新型抗生素的研發上市遠遠比不上細菌耐藥性的進展速度，因此抗生素的合理使用非常重要。臨床治療中應根據藥敏結果針對不同個體采取不同的用藥措施，做到有針對性的治療，且臨床醫師和感控人員應強化無菌觀念，盡量減少有創操作，做好全方位的感染防控工作，如加強手衛生、定期監測耐藥菌感染，并實時上報、做好感染者的隔離防護等，避免院內交叉感染的發生。目前T-CRKP的耐藥機制研究尚未完全明確，需進一步探究，治療上當前可選用的抗生素包括磷霉素、慶大霉素和多黏菌素等，以及新型復合型抗生素如頭孢他啶、阿維巴坦等。相信隨著研究聯合臨床調查的深入，會出現更有效的抗生素來應對T-CRKP感染。