支氣管哮喘患兒基質金屬蛋白酶-16、自噬相關基因5和自噬相關基因7的表達及其與肺功能的相關性

許花芬, 馮 瓊, 李春蕾

(海南省人民醫院 新生兒科, 海南 海口, 570311)

支氣管哮喘(簡稱哮喘)是兒童時期常見的慢性呼吸系統疾病，其主要病理特點為慢性氣道炎癥、氣道重塑、氣道高反應性等[1]。哮喘嚴重威脅患兒生活質量及心理健康，給家庭及社會帶來沉重負擔[2]。相關研究[3]顯示，微小RNA-30a(miRNA-30a)靶向自噬相關基因5(ATG5), 并通過抑制自噬減輕哮喘患者氣道纖維化。LOU L L等[4]研究表明, miRNA-192-5p通過靶向基質金屬蛋白酶-16(MMP-16)和自噬相關基因7(ATG7)減輕哮喘患者氣道重塑，推測MMP-16、ATG5、ATG7可能在哮喘的發生發展中發揮重要作用。目前，有關MMP-16、ATG5、ATG7與哮喘病情程度及肺功能相關性的研究仍較少。本研究分析哮喘患兒外周血單個核細胞MMP-16mRNA、ATG5mRNA、ATG7mRNA與肺功能的相關性，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取本院2020年1月—2021年3月住院的哮喘患兒80例作為觀察組，男42例，女38例，年齡4～13歲，平均(7.02±2.16)歲; 將急性發作期患兒根據病情程度分為輕度組46例和中重度組34例。選取同期本院體檢兒童80例作為對照組，男43例，女37例，年齡5～13歲，平均(7.14±2.09)歲。納入標準: ① 符合兒童支氣管哮喘的診斷標準者[5]; ② 患兒無嚴重哭鬧現象，依從性良好，可配合完成本研究; ③ 患兒臨床資料齊全，對照組無近期感染疾病史、變態反應性疾病史以及家族過敏性疾病，哮喘患兒均為新發或停止規范吸入糖皮質激素超過3個月的復發哮喘; ④ 兒童監護人自愿參加本研究，同時簽署知情同意書，本研究獲本院臨床倫理委員會審核通過。排除標準: ① 伴有先天性代謝性疾病、免疫系統疾病及感染性疾病者; ② 過敏性哮喘或因支氣管、肺發育不良等疾病而引起喘息、咳嗽、氣促者; ③ 伴有重要臟器功能障礙或惡性腫瘤者。

1.2 主要試劑與儀器

RNA提取試劑盒(貨號R1200-100)購自北京索萊寶科技有限公司; 反轉錄試劑盒(貨號RE0510-100T)購自定州百克賽斯生物科技有限公司; SYBR Green Master Mix(貨號BYGL-GK10002)購自南京北魚生物科技有限公司; 肺功能檢測儀(型號HI-801)購自日本捷斯特公司; 實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)儀(型號CFX96)購自美國Bio-Rad公司。

1.3 研究方法

1.3.1 樣品采集及保存: 抽取各組(觀察組患兒分別于急性發作期和臨床緩解期各采集1次血樣)空腹外周靜脈血樣置于離心管中，并加入同等體積的磷酸鹽緩沖液(PBS)充分混勻，稀釋后將其緩慢、貼壁加入盛有外周血淋巴細胞分離液的離心管中，切忌破壞界面。將樣品放入離心機中, 3 000轉/min離心15 min后可見離心管中出現明顯分層。收集乳白色外周血單個核細胞層到EP管, 2 000轉/min低溫離心5 min。棄上清，收集乳白色細胞后加入5倍體積的PBS, 1 000轉/min低溫離心10 min, 棄上清，重復2～3次, -80 ℃保存備用。

1.3.2 外周血單個核細胞MMP-16mRNA、ATG5mRNA和ATG7mRNA水平檢測: 采用qRT-PCR法檢測外周血單個核細胞MMP-16mRNA、ATG5mRNA和ATG7mRNA水平。采用RNA提取試劑盒提取外周血單個核細胞總RNA，測定純度及濃度后采用反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA。采用Genbank獲得基因號，引物設計軟件設計引物后委托上海生工生物工程股份有限公司合成。qRT-PCR反應體系: cDNA(50 ng/μL)5 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各2 μL, SYBR Green Master Mix 25 μL, ddH2O 16 μL。各樣品設3個重復，采用2-△△CT法計算外周血單個核細胞MMP-16mRNA、ATG5mRNA和ATG7mRNA相對表達量,GAPDH為內參基因，引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.3 肺功能指標檢測: 采用肺功能檢測儀檢測各組(觀察組患兒分別于急性發作期和臨床緩解期各檢測1次)兒童肺功能指標，包括第1秒用力呼氣容積占預計值百分比(FEV1%)、用力肺活量(FVC)、最大呼氣峰流速占預計值百分比(PEF%), 計算第1秒用力呼氣容積占用力肺活量的比率(FEV1/FVC), 操作步驟均嚴格按照儀器使用說明書進行。

1.4 統計學分析

2 結 果

2.1 觀察組與對照組外周血單個核細胞

MMP-16mRNA、ATG5mRNA和

ATG7mRNA水平比較

觀察組急性發作期和臨床緩解期外周血單個核細胞MMP-16mRNA、ATG5mRNA和ATG7mRNA水平高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。觀察組組內比較發現，急性發作期外周血單個核細胞MMP-16mRNA、ATG5mRNA和ATG7mRNA水平高于臨床緩解期，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 觀察組與對照組外周血單個核細胞MMP-16 mRNA、ATG5 mRNA和ATG7 mRNA水平比較

2.2 觀察組與對照組肺功能指標比較

觀察組急性發作期和臨床緩解期FEV1%、FEV1/FVC和PEF%低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05); 觀察組組內比較發現，急性發作期FEV1%、FEV1/FVC和PEF%低于臨床緩解期，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 觀察組與對照組肺功能指標比較 %

2.3 急性發作期哮喘患兒外周血單個核細胞

MMP-16mRNA、ATG5mRNA、ATG7mRNA

與肺功能指標的相關性

Pearson分析結果顯示，急性發作期哮喘患兒外周血單個核細胞MMP-16mRNA與ATG5mRNA、MMP-16mRNA與ATG7mRNA、ATG5mRNA與ATG7mRNA均呈顯著正相關(r=0.536、0.542、0.534,P<0.05)，且MMP-16mRNA、ATG5mRNA、ATG7mRNA與FEV1%、FEV1/FVC、PEF%均呈顯著負相關(P<0.05)。見圖1、表4。

A: MMP-16 mRNA與ATG5 mRNA的相關性; B: MMP-16 mRNA與ATG7 mRNA的相關性; C: ATG5 mRNA與ATG7 mRNA的相關性。圖1 急性發作期哮喘患兒外周血單個核細胞MMP-16 mRNA、ATG5 mRNA、ATG7 mRNA的相關性

表4 急性發作期哮喘患兒外周血單個核細胞MMP-16 mRNA、ATG5 mRNA、ATG7 mRNA與肺功能指標的相關性

2.4 輕度組與中重度組外周血單個核細胞MMP-16 mRNA、ATG5 mRNA、ATG7 mRNA及肺功能指標比較

與輕度組比較，中重度組外周血單個核細胞MMP-16mRNA、ATG5mRNA、ATG7mRNA水平較高, FEV1%、FEV1/FVC、PEF%較低，差異有統計學意義(P<0.05)。見表5。

表5 輕度組與中重度組外周血單個核細胞MMP-16 mRNA、ATG5 mRNA、ATG7 mRNA及肺功能指標比較

3 討 論

哮喘是一種氣道上皮下基底膜增厚、水腫、黏液高分泌、氣道平滑肌收縮的可逆性肺部疾病[6]。多種細胞及組分參與的炎性反應、氣道結構重塑和氣道上皮細胞損傷在哮喘發病中起重要作用[7-8]。哮喘發病機制較為復雜，任何單一途徑的治療手段都可能有局限性[9]。

MMP-16是一種分泌型基質金屬蛋白酶的活化劑，其細胞外活性主要受組織金屬酶抑制因子的控制，可作為預測癌癥化療敏感性的生物標志物[10]。MMP-16與細胞增殖、遷移、侵襲有關[11]。本研究中，哮喘患兒外周血單個核細胞MMP-16mRNA水平顯著升高，且隨著急性發作期哮喘患兒病情由輕度發展為中重度，外周血單個核細胞MMP-16mRNA水平呈現升高趨勢，結合LOU L L等[4]研究結論，推測MMP-16mRNA表達水平升高后，可能通過調控氣道上皮下基底膜增厚、膠原蛋白沉積而參與氣道結構重塑，進而影響哮喘的發生、發展。DUANX J等[12]研究結果表明, MMP-16與哮喘疾病中的炎癥反應有關。推測本研究中MMP-16mRNA的高表達也可能通過調控炎癥反應來加速哮喘疾病的發生發展。既往研究[13]證明，炎癥性疾病的發生發展可激活自噬，而自噬可反饋調節炎癥因子的表達及分泌，最終影響炎癥性疾病的預后及轉歸。

隨著對哮喘發病機制的不斷深入研究，學者[14]發現作為細胞死亡程序的自噬在哮喘疾病的發生發展中有重要作用。ATG與自噬密切相關，且在慢性阻塞性肺疾病的發生發展中起著重要作用[15]。目前研究較為廣泛的ATG包括ATG5、ATG7、ATG6等，其中ATG5、ATG7對自噬的發生起決定性作用[16]。本研究中，哮喘患兒外周血單個核細胞ATG5mRNA、ATG7mRNA水平顯著升高，且其水平隨著急性發作期哮喘患兒病情加重而進一步升高，結合LIB B等[3]研究結論，推測病理狀態下ATG5mRNA、ATG7mRNA表達水平上升，自噬水平上升，自噬降解蛋白質產生的氨基酸為膠原蛋白沉積提供能量和合成原料，進一步加重氣道纖維化和氣道重塑，加速哮喘病情進展。

本研究結果還表明，急性發作期哮喘患兒MMP-16mRNA、ATG5mRNA、ATG7mRNA水平與肺功能指標FEV1%、FEV1/FVC、PEF%均存在相關性，且隨著治療后臨床緩解期患兒肺功能的改善，MMP-16mRNA、ATG5mRNA、ATG7mRNA水平也隨之下降，此結果提示各指標變化對評估哮喘治療效果有重要作用，臨床中可通過檢測各指標水平變化，評估哮喘肺功能改善程度及治療效果，為制訂更有效的治療方法提供參考。本研究中，急性發作期哮喘患兒外周血單個核細胞中MMP-16mRNA、ATG5mRNA、ATG7mRNA均呈顯著正相關。胡紅霞等[17]研究結果顯示，ATG5可通過調節MMP-9影響細胞增殖和侵襲，推測MMP-16mRNA、ATG5mRNA、ATG7mRNA在哮喘的發病中可能同樣存在調控機制，其中ATG5mRNA、ATG7mRNA可能通過調控MMP-16mRNA的表達水平而參與哮喘的發生發展，其具體作用機制仍待進一步研究驗證。

綜上所述，哮喘患兒外周血單個核細胞MMP-16mRNA、ATG5mRNA、ATG7mRNA水平升高，且均與肺功能指標FEV1%、FEV1/FVC、PEF%呈顯著相關性。MMP-16、ATG5、ATG7可能作為新的治療靶點用于哮喘急性發作期的治療，為新靶點的進一步探究提供了思路。