腎衰寧片中黃連6種生物堿類成分含量測定研究

王 健，孫 菡，白 潔，王鈺寧，周亞楠*

（1. 秦皇島市食品藥品檢驗(yàn)中心，河北 秦皇島 066000；2. 河北省藥品醫(yī)療器械檢驗(yàn)研究院，河北 石家莊 050000）

腎衰寧片是由太子參、黃連、法半夏、陳皮、茯苓、大黃、丹參、牛膝、紅花、甘草等10味中藥材組成的復(fù)方制劑，具有益氣健脾，活血化瘀，通腑泄?jié)岬墓πВ饕糜谥委熎⑽笟馓摗狃鰞?nèi)阻、升降失調(diào)所致的面色萎黃、腰痛倦怠、惡心嘔吐、食欲不振、小便不利、大便黏滯等疾病。該制劑生產(chǎn)廠家有4個(gè)，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)有3個(gè)，分別為國家藥品標(biāo)準(zhǔn)YBZ01622006-2015Z、YBZ07042006、YBZ09322006，標(biāo)準(zhǔn)中均對黃連中鹽酸小檗堿進(jìn)行了含量測定，但方法和含量限度均不相同，且以鹽酸小檗堿單一成分作為質(zhì)量控制指標(biāo)，無法準(zhǔn)確反映藥材或制劑的質(zhì)量，難以達(dá)到全面控制藥品質(zhì)量的目的[1-4]。黃連的主要有效成分為生物堿類化合物，其中小檗堿含量最高，此外還有表小檗堿、黃連堿、巴馬汀、非洲防己堿、藥根堿等生物堿[5-7]。本試驗(yàn)建立同時(shí)測定腎衰寧片中鹽酸藥根堿、非洲防己堿、表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿6種黃連生物堿成分含量的方法，為更有效地控制腎衰寧片的質(zhì)量提供參考。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀（Waters e2695，配備PDA檢測器，美國Waters公司）；純水儀（Millipore公司）；超聲儀（KQ-500KDE，昆山市超聲儀器有限公司）；電子天平（美國Mettler公司， AE163、XPE1126）；甲醇、乙腈為色譜純，氨水、三乙胺、碳酸氫銨為優(yōu)級(jí)純；水為超純水；藥根堿對照品、黃連堿對照品、鹽酸巴馬汀對照品、鹽酸小檗堿對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)分別為110733-201909，112026-201601，110732-201611，110713-201212）；非洲防己堿對照品、表小檗堿對照品（成都曼斯特生物科技有限公司）；腎衰寧片22批，來自國內(nèi)4家藥品企業(yè)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：資生堂 AQ C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）；以乙腈（A）-0.06 mol/L碳酸氫銨溶液（每100 ml含1.4 ml濃氨水和0.3 ml三乙胺）（B）為流動(dòng)相，梯度洗脫：0～9 min，23 % A；9～15 min，23 %→25 % A；15～50 min，25 %→45 % A；檢測波長：345 nm；進(jìn)樣量：10 μl；柱溫：30 ℃；流速為1.0 ml/min。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

取鹽酸藥根堿、非洲防己堿、表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀對照品適量，分別加甲醇適量，超聲使溶解并稀釋制成含量為0.479，0.528，0.484，0.509，0.193 mg/ml對照品貯備液。取鹽酸小檗堿對照品約9 mg，精密稱定，置入100 ml量瓶；再分別精密量取鹽酸藥根堿對照品貯備液1.0 ml、非洲防己堿對照品貯備液2.0 ml、表小檗堿對照品貯備液2.0 ml、鹽酸黃連堿對照品貯備液5.0 ml、鹽酸巴馬汀對照品貯備液10.0 ml，置入含鹽酸小檗堿對照品的量瓶，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取本品，研細(xì)，取粉末約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇-鹽酸（100:1）的混合溶液25 ml，密塞，稱定重量，超聲處理（功率700 W，頻率80 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇-鹽酸（100:1）的混合溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 陰性樣品溶液制備

按照處方和制法，制備不含黃連的陰性樣品，按2.3項(xiàng)下方法制備陰性樣品溶液，即得。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 專屬性試驗(yàn) 分別取上述混合對照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液，于2.1項(xiàng)色譜條件下測定，結(jié)果見圖1。由圖1可見，在該色譜條件下，6種成分色譜峰分離度良好，理論塔板數(shù)按鹽酸小檗堿計(jì)大于5000，陰性無干擾。

圖1 混合對照品和樣品的液相色譜圖

2.5.2 線性關(guān)系考察 分別精密量取鹽酸藥根堿對照品溶液（濃度0.000 698 mg/ml 5，10，20 μl；濃度0.005 82 mg/ml 5，10，20 μl；濃度0.023 29 mg/ml 10 μl），非洲防己堿對照品溶液（濃度0.000 797 mg/ml 5，10，20 μl；濃度0.00664 mg/ml 5，10，20 μl；濃度0.026 57 mg/ml 10 μl），表小檗堿對照品溶液（濃度0.001 45 mg/ml 5，10，20 μl；濃度0.012 10 mg/ml 5，10，20 μl；濃度0.048 4 mg/ml 10 μl），鹽酸黃連堿對照品溶液（濃度0.002 95 mg/ml 5，10，20 μl；濃度0.024 58 mg/ml 5，10，20 μl；濃度0.098 3 mg/ml 10 μl），鹽酸巴馬汀對照品溶液（濃度0.003 02 mg/ml 5，10，20 μl；濃度0.025 15 mg/ml 5，10，20 μl；濃度0.1006 mg/ml 10 μl），鹽酸小檗堿對照品溶液（濃度0.010 28 mg/ml 5，10，20 μl；濃度0.085 7 mg/ml 5，10，20 μl；濃度0.342 8 mg/ml 10 μl），注入液相色譜儀，按擬定的色譜條件測定，記錄峰面積。以對照品進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，對照品的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得回歸方程。結(jié)果見表1，表明各成分線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系結(jié)果

2.5.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取腎衰寧片樣品（批號(hào)：20181001），研細(xì)，分別稱取0.25，0.5，0.75 g各3份，精密稱定，按2.3項(xiàng)下方法平行制備9份供試品溶液，進(jìn)行測定，計(jì)算得各待測成分的平均含量（n=9）及RSD值，結(jié)果見表2，表明該方法重復(fù)性良好。

表2 腎衰寧片中含量測定穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.5.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取腎衰寧片樣品（批號(hào)：20181001），研細(xì)，取細(xì)粉0.5 g，精密稱定，按2.3項(xiàng)下配制供試品溶液，分別于制備后0，3，6，12，16，24 h進(jìn)樣分析，計(jì)算各成分峰面積RSD值，結(jié)果見表2。表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.5.6 加樣回收試驗(yàn) 取腎衰寧片樣品（批號(hào)：20181001），研細(xì)，取0.25 g，精密稱定，每3份為一組，分別精密加入用溶液配制的低、中、高（低、中、高濃度各成分質(zhì)量濃度分別為鹽酸藥根堿0.0014，0.0028，0.0056 mg/ml；非洲防己堿0.0016，0.0032，0.0085 mg/ml；表小檗堿0.0039，0.0058，0.0098 mg/ml；鹽酸黃連堿0.0044，0.0079，0.0147 mg/ml；鹽酸巴馬汀0.0038，0.0077，0.0154 mg/ml；鹽酸小檗堿0.0213，0.0444，0.0639 mg/ml）3個(gè)濃度的混合對照品溶液25 ml，按2.3項(xiàng)下方法平行制備9份供試品溶液，進(jìn)行測定，計(jì)算鹽酸藥根堿、非洲防己堿、鹽酸黃連堿、表小檗堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿6個(gè)成分的加樣回收率及RSD，結(jié)果見表3，表明本方法回收率良好。

表3 回收率試驗(yàn)結(jié)果

表3（續(xù)）

2.6 樣品測定結(jié)果

將全部腎衰寧片樣品（共22批），分別按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，每批次平行3份，按2.1項(xiàng)下色譜條件測定，用外標(biāo)法分別計(jì)算鹽酸藥根堿、非洲防己堿、鹽酸黃連堿、表小檗堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿6種成分的含量，結(jié)果見表4。

表4 樣品中6種成分含量測定結(jié)果/mg·g-1（n=3）

3 討論

3.1 提取方式及溶劑考察

文獻(xiàn)中黃連的提取溶劑多用甲醇或甲醇-鹽酸[8-9]，本實(shí)驗(yàn)方法中對供試品制備過程中提取方式（超聲、回流）及提取溶劑（甲醇、鹽酸-甲醇）進(jìn)行了考察，結(jié)果表明，用甲醇-鹽酸（100:1）為提取溶劑，超聲處理30 min時(shí) 6 種生物堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高。

3.2 色譜條件及檢測波長的選擇

本實(shí)驗(yàn)分別考察了乙腈-0.1 %磷酸（每1000 ml磷酸溶液中 加2 ml三乙胺）、乙腈-0.1 %磷酸、乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液等流動(dòng)相條件，上述流動(dòng)相均未能使鹽酸藥根堿與非洲防己堿達(dá)到基線分離。最終選擇乙腈-0.06 mol/L碳酸氫銨溶液為流動(dòng)相，色譜峰分離度較好[10]。采用PDA檢測器于200～400 nm 波長進(jìn)行UV全波長掃描，結(jié)果6種生物堿均在345 nm波長有較大吸收，同時(shí)結(jié)合分析文獻(xiàn)報(bào)道情況[11-12]，選擇345 nm 為檢測波長。

3.3 耐用性考察

取腎衰寧片樣品，分別采用不同品牌的液相色譜儀及色譜柱，進(jìn)行測定鹽酸藥根堿、非洲防己堿、表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿含量。結(jié)果含量測定結(jié)果RSD值均小于3 %，表明方法耐用性良好。

3.4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用HPLC對腎衰寧片中鹽酸藥根堿、非洲防己堿、表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿6種黃連生物堿成分含量進(jìn)行測定，方法的專屬性、重復(fù)性、準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性均較好。測定的22批樣品結(jié)果表明，不同批次間樣品測定結(jié)果存在一定的差異。相對于現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)對鹽酸小檗堿的單成分含量測定，多組分的含量測定更能全面反映樣品中黃連飲片的質(zhì)量，能更加科學(xué)地評(píng)價(jià)藥品質(zhì)量，為提高該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)奠定基礎(chǔ)。