兒童類化妝品微生物檢查方法學(xué)研究

杭 婧，邢海艷

（淮安市食品藥品檢驗所，江蘇 淮安 223300）

與成人相比，嬰幼兒皮膚有以下特點(diǎn)：更薄更柔弱，皮脂少，低pH值平衡的能力，更易干燥，黑色素含量低，高光敏度[1]。嬰幼兒皮膚屏障較脆弱，生活在同樣的環(huán)境中，在同樣的刺激因素作用下，嬰幼兒比正常成人皮膚更易出現(xiàn)敏感癥狀[2]；對嬰幼兒的皮膚刺激會進(jìn)一步導(dǎo)致皮膚通透性提高，從而引起微生物的二次入侵[3]。微生物還可能產(chǎn)生毒素，導(dǎo)致皮膚感染, 嚴(yán)重的會誘發(fā)敗血癥[4]。我國現(xiàn)行的2015年版《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》[5]（以下簡稱《規(guī)范》）中允許使用的防腐劑有51種，除去三歲以下兒童禁用的3種防腐劑后，仍有48種。防腐劑通過作用于微生物的細(xì)胞膜、細(xì)胞壁和酶等多個靶點(diǎn), 破壞細(xì)胞分裂，抑制細(xì)菌生長和繁殖[6]。微生物檢驗通過在培養(yǎng)基中加入卵磷脂或聚山梨酯80，中和化妝品中的防腐劑等抑菌物質(zhì)。但實際生活中化妝品防腐劑多種多樣，添加防腐劑的濃度各不相同，因此很難保證防腐劑和其他抑菌成分被有效中和，從而出現(xiàn)化妝品中的微生物檢測項目很少超標(biāo)現(xiàn)象。因此，本文參考USP34版中防腐劑體系對微生物的抑殺效果試驗[7]和中國藥典2020年版中微生物限度檢查方法進(jìn)行適用性試驗[8]。選取目前市場中使用功效上常見的兒童用化妝品：清潔類1種、保濕類2種、爽身類1種、防曬類2種，進(jìn)行微生物方法學(xué)研究，通過進(jìn)行方法適用性試驗，中和或消除化妝品內(nèi)防腐劑等物質(zhì)的抑菌作用，旨在真實反映產(chǎn)品微生物污染情況。

1 儀器與材料

1.1 儀器

BCM-1600A潔凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；101-3電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海躍進(jìn)有限公司）；SPX-350型生化培養(yǎng)箱；MLS-3781L-PC型高壓蒸汽滅菌鍋（松下）；BagMixer 400CC均質(zhì)器（法國Interscience）；HTY-2000B集菌儀（杭州泰林生物技術(shù)設(shè)備公司）；BSC-1304IIA2生物安全柜（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；PL6001電子天平（梅特勒公司）；BHS-6水浴鍋（JOANLAB）。Waters 2695/2998高效液相色譜儀（美國Waters公司）；戴安U3000高效液相色譜儀（美國賽默飛公司）；Waters Symmtery C18（2.1 mm×250 mm，5 μm），資生堂CAPCELL PAK MG ⅡC18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），Millipore超純水機(jī)（美國Millipore公司），0.45 μm有機(jī)系針筒式微孔濾膜（上海安譜公司）。

1.2 試驗樣品

試驗樣品信息、標(biāo)識防腐劑類型及含量見表1。

表1 樣品信息、標(biāo)識防腐劑的類型及含量

1.3 菌株

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)[CMCC(B)26003]、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC(B)10104]、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[CMCC(B)63501]、白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC(F)98001]、黑曲霉（Aspergillusniger）[CMCC(F)98003]、大腸埃希菌（Escherichia coli）[CMCC(B)44102]，以上菌株來自中國食品藥品檢定研究院。

1.4 培養(yǎng)基與試劑

卵磷脂-吐溫80營養(yǎng)瓊脂（批號：1090181），孟加拉紅（虎紅）瓊脂（批號：1096661）、SCDLP液體培養(yǎng)基（批號：1087061），雙倍乳糖膽鹽（含中和劑）培養(yǎng)基（批號：1080131）、Baird-Parker瓊脂基礎(chǔ)（批號：1092405）、溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基（批號：1081171）、伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基（批號：1091601），以上培養(yǎng)基規(guī)格均為250 g；卵黃亞碲酸鉀增菌液（批號：6108128），以上培養(yǎng)基和試劑均來源于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。0.9 %無菌氯化鈉注射液（250 ml:2.25 g，江蘇淮安雙鶴藥業(yè)有限公司，批號：200514 2C），吐溫80（CP，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號：20190812），液體石蠟（AR，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號：20200616）。磷酸（麥克林試劑公司），色譜純乙腈（德國，默克公司），色譜純甲醇（德國，默克公司）。苯甲酸、苯氧乙醇、山梨酸（中國食品藥品檢定研究院，純度均大于99.0 %）。

2 方法

2.1 菌液制備

選取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉的三代新鮮培養(yǎng)物，用0.9 %無菌氯化鈉溶液采用十倍稀釋法將上述菌種制成每l ml含菌數(shù)小于100 cfu的菌懸液。

2.2 供試液制備

按照《規(guī)范》進(jìn)行供試液制備。樣品A和樣品C：各吸取 10 ml 加至 90 ml滅菌生理鹽水中，混勻后，制成1:10的檢液。樣品D：取樣品 10 ml，先加5 ml滅菌液體石蠟混勻，再加10 ml滅菌的吐溫80，于40～44 ℃水浴中振蕩混勻10 min，加入滅菌的生理鹽水 75 ml，于40～44 ℃水浴中乳化，制成 1:10懸液。樣品B、E、F稱取 10 g，加10 ml滅菌液體石蠟，10 ml吐溫 80，70 ml滅菌生理鹽水，使用均質(zhì)器均質(zhì)3～5 min，充分混合，制成 1:10檢液 。

2.3 微生物計數(shù)方法適用性試驗

2.3.1 常規(guī)法：① 試驗組 取供試液10 ml加入2.1中制備的5種試驗菌液0.1 ml，混勻，使每1 ml供試液中含菌量≤100 cfu，每皿加1 ml含菌供試液，傾注15～20 ml卵磷脂吐溫 80 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，瓊脂冷卻凝固后倒置平皿，置36 ℃培養(yǎng)48 h，霉菌和酵母菌澆注15～20 ml虎紅培養(yǎng)基，置 28 ℃培養(yǎng) 5 d，同時均設(shè)空白對照。② 菌液組 用稀釋液代替供試液，按上述①組步驟加入5種試驗菌液并進(jìn)行微生物回收試驗。③ 供試品對照組 取制備好的供試液，用稀釋液替換5種菌液，其余步驟同①組。參考《中國藥典》2020年版四部，回收比值=（試驗組菌落數(shù)-供試品對照組菌落數(shù)）/菌液對照組菌落數(shù)。5種試驗菌回收比值在0.5～2，符合方法適用性試驗要求。若試驗組菌落數(shù)減去供試品對照組菌落數(shù)的值小于菌液對照組菌落數(shù)的50 %，可采用培養(yǎng)基體積稀釋的方法、加中和法、薄膜過濾法等方法[8]。

2.3.2 中和劑法 用含0.1 mol/L的氯化鎂中和劑的無菌氯化鈉制成1:10供試液 ，增加中和劑對照組：取含0.1 mol/L氯化鎂稀釋液10 ml加入2.1項中制備的5種試驗菌液0.1 ml，混勻，澆注適宜的卵磷脂吐溫80 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和虎紅培養(yǎng)基，其余組別同常規(guī)法。

2.3.3 培養(yǎng)基稀釋法 試驗組 分別取供試液0.5，0.2 ml/皿加入5種試驗菌液，混勻，其余操作同常規(guī)法。若回收比值低于50 %，可采用薄膜過濾法等方法。

2.3.4 薄膜過濾法 ① 試驗組 取按2.2項制備的1:10供試液1 ml加入50 ml稀釋液中，再加入小于100 cfu試驗菌菌懸液，進(jìn)行薄膜過濾。用0.9 %無菌氯化鈉溶液分3次進(jìn)行沖洗，每次沖洗100 ml。抽干并取出濾膜正面朝上貼于相應(yīng)的培養(yǎng)基并按規(guī)定溫度進(jìn)行培養(yǎng)。② 菌液組 取2.1項菌懸液1 ml加入50 ml稀釋液中，進(jìn)行薄膜過濾。用0.9 %無菌氯化鈉溶液分3次進(jìn)行沖洗，每次沖洗100 ml。抽干并取出濾膜正面朝上貼于相應(yīng)的培養(yǎng)基并按規(guī)定溫度進(jìn)行培養(yǎng)。③ 供試品對照組 取1:10供試液1 ml加入50 ml稀釋液中，進(jìn)行薄膜過濾。用0.9 %無菌氯化鈉溶液分3次進(jìn)行沖洗，每次沖洗100 ml。抽干并取出濾膜正面朝上貼于相應(yīng)的培養(yǎng)基并按規(guī)定溫度進(jìn)行培養(yǎng)。

2.4 控制菌方法適用性試驗

2.4.1 常規(guī)法 ① 耐熱大腸菌群（10 ml/管）：取1:10樣品10 ml，分別接種于2管10 ml雙倍乳糖膽鹽（含中和劑）培養(yǎng)基，其中一管不加大腸埃希菌作為陰性對照組，另一管加入≤100 cfu的大腸埃希菌作為試驗組。② 金黃色葡萄球菌（90 ml/瓶）：取1:10樣品10 ml，分別接種于兩瓶90 ml的SCDLP培養(yǎng)基中，其中一瓶不加金黃色葡萄球菌作為陰性對照組，另一瓶加入≤100 cfu的金黃色葡萄球菌作為試驗組。③ 銅綠假單胞菌（90 ml/瓶）：取1:10樣品10 ml，分別接種于90 ml的SCDLP培養(yǎng)基中，其中一瓶不加銅綠假單胞菌作為陰性對照組，另一管加入≤100 cfu的銅綠假單胞菌作為試驗組。

2.4.2 稀釋法 銅綠假單胞菌（200 ml/瓶）：取1:10樣品供試液10 ml，分別接種于兩瓶200 ml的SCDLP培養(yǎng)基中，其中一瓶不加銅綠假單胞菌作為陰性對照組，另一瓶加入≤100 cfu的銅綠假單胞菌作為試驗組，置36 ℃培養(yǎng)24 h，劃線于十六烷三甲基溴化銨瓊脂培養(yǎng)基，置36 ℃培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。金黃色葡萄球菌（200 ml/瓶）：取1:10樣品供試液10 ml，分別接種于兩瓶200 ml的SCDLP培養(yǎng)基中，其中一瓶不加金黃色葡萄球菌作為陰性對照組，另一瓶加入≤100 cfu的金黃色葡萄球菌作為試驗組，置36 ℃培養(yǎng)24 h，劃線于Baird Parker培養(yǎng)基，置36 ℃培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。

3 結(jié)果與分析

3.1 微生物限度回收率

以中國藥典2020年版中各試驗菌回收比值在0.5～2為參考標(biāo)準(zhǔn)，樣品A中金黃色葡萄球菌直到采用薄膜過濾法時，金黃色葡萄球菌以及枯草芽孢桿菌回收率達(dá)到要求，可見樣品A代表的兒童發(fā)用沐浴類抑菌性較強(qiáng)，對5種試驗菌均有較強(qiáng)的抑菌作用；采用現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)的常規(guī)法難以檢出目標(biāo)菌，現(xiàn)行兒童化妝品微生物檢驗標(biāo)準(zhǔn)有待優(yōu)化。采用培養(yǎng)基稀釋法（0.2 ml/皿）對樣品B進(jìn)行需氧菌試驗，常規(guī)法對霉菌和酵母菌總數(shù)進(jìn)行試驗。樣品D采用中和劑法時，白色念珠菌的回收率符合要求，故采用常規(guī)法對樣品D進(jìn)行需氧菌試驗，中和劑法對霉菌和酵母菌總數(shù)進(jìn)行試驗。樣品E采用培養(yǎng)基稀釋法（0.2 ml/皿）時，銅綠假單胞菌回收率達(dá)到回收率要求。故采用培養(yǎng)基稀釋法（0.2 ml/皿）對樣品E進(jìn)行需氧菌試驗，常規(guī)法對霉菌和酵母菌總數(shù)進(jìn)行試驗。樣品C和樣品F采用常規(guī)法進(jìn)行實驗時，5種試驗菌回收率均可達(dá)到50 %以上，故樣品C和樣品F可采用常規(guī)法（1 ml/皿）進(jìn)行需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)的計數(shù)檢查。結(jié)果見表2。

表2 計數(shù)方法適用性試驗回收率/%

3.2 控制菌檢查方法適用性

結(jié)果見表3。樣品B、樣品C、樣品E、樣品F采用常規(guī)法進(jìn)行控制菌（耐熱大腸菌群10 ml/管、金黃色葡萄球菌90 ml/瓶、銅綠假單胞菌90 ml/瓶）方法學(xué)驗證時，試驗菌均可檢出：雙倍乳糖膽鹽（含中和劑）發(fā)酵管產(chǎn)酸產(chǎn)氣，伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基（EMB）上呈紫黑色圓形且?guī)Ы饘俟鉂傻木洌锾m染色為G-短桿菌，靛基質(zhì)試驗呈陽性結(jié)果，陰性對照組均無菌生長，可見樣品B、C、E、F可采用常規(guī)法（10 ml/管）進(jìn)行耐熱大腸菌群試驗。樣品A采用90 ml/瓶進(jìn)行金黃色葡萄球菌進(jìn)行實驗時，試驗菌未生長，培養(yǎng)基體積增加至200 ml/瓶時，檢出金黃色葡萄球菌：SCDLP培養(yǎng)基渾濁生長，Baird Parker平板上呈黑色圓形菌落，周圍有渾濁帶，其外層有透明帶，革蘭染色為G＋球菌呈葡萄串狀排列，甘露醇發(fā)酵試驗和血漿凝固酶試驗均呈陽性反應(yīng)，陰性對照組均未長菌，可見樣品A可采用培養(yǎng)基稀釋法（200 ml/瓶）進(jìn)行金黃色葡萄球菌試驗。樣品D采用90 ml/瓶進(jìn)行銅綠假單胞菌實驗時，試驗菌未生長，直到采用200 ml/瓶時，檢出銅綠假單胞菌：SCDLP培養(yǎng)基渾濁生長，十六烷三甲基溴化銨平板上呈灰白色菌落，周圍藍(lán)綠色素擴(kuò)散，革蘭染色為G-短桿菌，氧化酶試驗和綠膿菌素試驗均呈陽性反應(yīng)，陰性對照組均未長菌，可見樣品D可采用培養(yǎng)基稀釋法（200 ml/瓶）進(jìn)行銅綠假單胞菌試驗。

表3 控制菌方法學(xué)研究結(jié)果

4 討論

樣品A對5種試驗菌均有不同程度的抑菌作用，其中金黃色葡萄球菌采用前四種驗證方法時回收率均為0，表明其對G＋球菌有很強(qiáng)的抑菌作用；樣品B和E對G-桿菌有抑菌作用；樣品D中白色念珠菌采用中和劑法回收率可達(dá)到回收標(biāo)準(zhǔn)，表明中和劑可提高樣品中真菌類微生物生長，減少假陰性結(jié)果出現(xiàn)。此結(jié)果與文獻(xiàn)[9-10]報道一致，由樣品A的結(jié)果可見，中和劑法并未明顯提高樣品霉菌和酵母菌的試驗回收率，此處考慮與中和劑對不同的防腐劑中和效果不同有關(guān)。結(jié)果表明，用目前的化妝品法定方法并不能全部檢出樣品內(nèi)的微生物，故需要進(jìn)行方法優(yōu)化，抑菌性低的樣品采用稀釋法、中和劑法，抑菌性高的樣品采用薄膜過濾法或幾種方法聯(lián)用，提高陽性檢出率，降低兒童使用化妝品感染微生物的風(fēng)險。

傳統(tǒng)的化學(xué)防腐劑抑菌效果好，如苯氧乙醇有廣譜抑菌性，特別是對于銅綠假單胞菌有較好的滅菌效果[11]，這也一定程度解釋了樣品A、B、E對銅綠假單胞菌有不同程度的抑菌作用。目前市場上，各種兒童護(hù)膚產(chǎn)品愈發(fā)豐富，同時出現(xiàn)很多“防腐劑零添加”“天然植物成分”的兒童用化妝品來吸引消費(fèi)者。兒童化妝品中防腐劑的成分和含量，與抑制微生物能力之間的關(guān)聯(lián)有待進(jìn)一步研究。本研究可對目前兒童化妝品市場的抽樣檢驗及市場監(jiān)管提供參考。