復方黃柏口腔護理液體外抑菌及刺激性評價研究

許慶友，徐鳳霞，任松鵬，韓德鳳，李 連，臧恒昌

（1. 山東大學藥學院，山東 濟南 250012；2. 山東漢方制藥有限公司，山東 濟南 250000；3. 國家藥品監督管理局藥物制劑技術研究與評價重點實驗室，山東 濟南 250012）

口腔健康是全身健康的重要組成部分，口腔微生物菌群及自身免疫失調是導致口腔疾病乃至全身疾病的重要原因[1-2]。對于治療口腔疾病，有臨床研究發現，抗菌藥物聯合辯證清熱解毒藥物的中西醫結合療法，可顯著提高機體免疫和治療效果[3]。

復方黃柏液涂劑為已上市中成藥，由連翹、黃柏、金銀花、蒲公英、蜈蚣配伍，經水提醇沉工藝制備而成，無添加任何抑菌防腐劑；清熱解毒，消腫祛腐，用于瘡瘍潰后，傷口感染，屬陽證者；治療范圍從體表皮膚損傷至內臟腔道黏膜損傷，具有較高的臨床應用價值。現代藥理學研究表明，復方黃柏液涂劑具有抑菌、消炎、促愈合、增強局部非特異性免疫的作用[4-7]。口腔科應用方面亦有治療口瘡、口腔黏膜炎等臨床報道[8-9]。但復方黃柏液涂劑用于治療口腔疾病時，口味較苦，患者往往難以接受。本研究在復方黃柏液涂劑處方工藝基礎上，配伍薄荷腦和抗抑菌成分的葡萄糖酸氯己定，并加入適量甜菊糖苷、食用香精矯味，制備成復方黃柏口腔護理液，并實驗觀察其抑菌作用和黏膜刺激性。

1 材料

1.1 原輔料

連翹（批號：191127）、黃柏（批號：1908061）、金銀花（批號：191108）、蒲公英（批號：190911）、蜈蚣（批號：201023）由山東漢方制藥有限公司提供，符合中國藥典質量要求。

20 %葡萄糖酸氯己定（批號：190304，錦州九泰藥業有限公司）；吐溫80（批號：20190628），丙二醇（批號：20181116，國藥集團化學試劑有限公司）；薄荷腦（批號：X190508，黃山天目薄荷藥業有限公司）；甜菊糖苷（批號：20190906，曲阜圣仁制藥有限公司）。

1.2 菌株

金黃色葡萄球菌（ATCC 6538）、大腸桿菌（ATCC 8099），取其第9代新鮮斜面培養物進行試驗；白色念珠菌（ATCC 10231），取其第7代新鮮斜面培養物進行試驗，由廣東省食品微生物安全工程技術研究開發中心提供。

1.3 實驗動物

普通級新西蘭兔3只，雄性。合格證號：No.1108222011000319，由山東省濟南西嶺角養殖繁育中心提供，實驗動物生產許可證號：SCXK（魯）2015 0001。

2 方法

2.1 口腔護理液制備

取連翹、黃柏、金銀花、蒲公英、蜈蚣，以上五味，加水煎煮3次，第一次1 h，第二次45 min，第三次30 min，合并煎液；濾過，濾液濃縮至相對密度為1.10～1.15（50 ℃）的清膏，加乙醇使含醇量達70 %，靜置24 h，濾過，濾液減壓濃縮至無醇味，加水至100 ml，攪勻，靜置，冷藏24 h，濾過，依次攪拌加入吐溫80適量、20 %葡萄糖酸氯己定溶液2.5 g、薄荷腦丙二醇溶液適量、甜菊糖苷適量，食用香精適量，混勻，加水調節至1000 ml，即得。

2.2 抑菌試驗[10]

2.2.1 制備抑菌片 取滅菌并干燥的直徑為5 mm的新華1號定性濾紙片。每片滴加2.1項制備的口腔護理溶液 20 μl，將濾紙片鋪于無菌平皿內，半密封狀態置干燥箱（37 ℃）中烘干，備用。

2.2.2 制備陰性對照樣片 同2.2.1項，取滅菌處理并且干燥后的濾紙片，每張濾紙片上滴加無菌蒸餾水20 μl，干燥后備用。

2.2.3 接種試驗菌 用涂布工具，酒精燈火焰滅菌并冷卻后，蘸取濃度為5×105～5×106cfu/ml 試驗菌懸液，在營養瓊脂培養基平板表面均勻涂布。蓋好平皿，室溫下干燥5 min。

2.2.4 抑菌劑樣片貼放 用無菌鑷子取樣片貼放于平板表面。貼放好后，用無菌鑷子輕壓樣片，使其緊貼于平板表面。每個平皿貼放5張樣片，其中4張抑菌片、1張陰性對照樣片，使各樣片中心之間相距25 mm以上，與平板的周緣相距 15 mm 以上，蓋好平皿，置37 ℃恒溫培養箱中，培養16～18 h 觀察結果。用游標卡尺測量抑菌環的直徑（包括貼片）并記錄。試驗重復3次。

2.2.5 評價規定 抑菌環直徑大于7 mm者，判為有抑菌作用。抑菌環直徑小于或等于7 mm者，判為無抑菌作用。3 次重復試驗均有抑菌作用結果者，判為合格。陰性對照組應無抑菌環產生。否則試驗無效。

2.3 急性眼刺激試驗[10]

參照《消毒產品衛生安全評價規定》，用于黏膜的抗（抑）菌制劑應當進行眼刺激性試驗[11]。

2.3.1 實驗動物準備 試驗前24 h內檢查每只新西蘭兔的雙眼是否有異常現象，發現有異常現象則淘汰。

2.3.2 染毒方法 采用同體左右側自身對比法，取受試物原液0.1 ml滴入左側眼結膜囊內，將眼睛被動閉合4 s，30 s后用氯化鈉注射液沖洗。右側眼睛同法給予氯化鈉注射液0.1 ml作為陰性對照組。

2.3.3 結果記錄 滴受試物后，將眼被動閉合4 s，30 s后用生理鹽水沖洗。分別在24，48，72 h肉眼觀察新西蘭兔眼結膜、虹膜和角膜的損傷與恢復情況并記錄。如有刺激反應情況下，可繼續觀察記錄7，14和21 d情況；如果72 h內未出現刺激反應，或第7天或第14天，眼睛刺激反應完全恢復，即可提前終止試驗。

2.3.4 評價規定 按《消毒技術規范》（2002年版）表2-13對家兔眼角膜、虹膜和結膜的急性刺激反應進行評分，并分別計算每只動物在3個不同觀察時間（24，48和72 h）角膜損害、虹膜損害、結膜充血和結膜水腫四方面的“平均評分”。分別以動物眼角膜、虹膜和結膜充血、水腫的平均評分和恢復時間進行，按《消毒技術規范》（2002年版）表2-14、表2-15眼刺激反應分級標準判定受試物對眼睛的刺激強度。

3 結果

3.1 抑菌試驗

口腔護理液原液對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、白色念珠菌的抑菌環數據分別見表1～表3。

表1 樣品原液對金黃色葡萄球菌的抑菌環直徑

表2 樣品原液對大腸桿菌的抑菌環直徑

表3 樣品原液對白色念珠菌的抑菌環直徑

由表1～表3可見，依據《消毒技術規范》（2002 年版），在試驗條件下，由口腔護理液原液對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、白色念珠菌的平均抑菌環直徑可見，口腔護理液原液對上述3個菌種均有抑菌作用，符合《消毒技術規范》（2002年版）標準要求。抑菌作用金黃色葡萄球菌＞大腸桿菌＞白色念珠菌。

3.2 急性眼刺激試驗

口腔護理液原液對受試物角膜損害、虹膜損害、結膜充血和結膜水腫情況見表4。

表4 急性眼刺激試驗評分結果

由表4可見，本實驗條件下，該樣品原液對新西蘭兔眼刺激的損傷類型為無刺激性，符合《消毒技術規范》（2002年版）的要求。

4 討論

基于復方黃柏液涂劑對于陽證型黏膜損傷廣泛而良好的臨床應用反饋，以及口腔部位常見疾病特點，復方黃柏口腔護理液組方最終選擇以葡萄糖酸氯己定為抑菌防腐劑。因葡萄糖酸氯己定有長效廣譜抑菌作用，可顯著抑制致齲菌生長、抗菌斑形成[12]，同時對于破損皮膚刺激性較低，安全性高[13]；常用于牙齦炎、冠周炎、口腔黏膜炎等引致的牙齦出血、牙周膿腫、口腔黏膜潰瘍等輔助治療。本組方中薄荷腦作為清涼矯味劑、促透劑，同時也有疏風清熱功效[14]，以協同增強連翹、黃柏、金銀花、蒲公英、蜈蚣組合的清熱解毒效力。

至于新配方制備的復方黃柏口腔護理液在護理治療包括口腔潰瘍、牙齦腫痛等在內的陽證型口腔疾病療效上，與復方黃柏液涂劑相比是否提高，有待進一步臨床驗證。